Méthode d’essai biologique : essai de croissance et de survie sur les têtes-de-boule

Série de la protection de l'environnement

Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes
Direction générale des sciences et de la technologie
Environnement Canada
Ottawa (Ontario)

Rapport SPE 1/RM/22

Deuxième édition
Février 2011

Version PDF - 679 Ko

Table des matières

Commentaires

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Richard Scroggins,
Chef, Section des méthodes biologiques
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A OH3

Lisa Taylor, Gestionnaire
Élaboration et application des méthodes
Environnement Canada
335, chemin River
Ottawa (Ontario)
K1A OH3

Mise en garde

Le présent rapport a été examiné par le personnel de la Direction générale de l’avancement des technologies environnementales d’Environnement Canada. La mention de marques de commerce ou de produits commerciaux dans ce document ne signifie pas leur approbation ou recommandation par Environnement Canada. Il existe d’autres produits de valeur similaire.

Résumé

Le présent document expose une méthode révisée, maintenant recommandée par Environnement Canada, pour l’exécution d’essais de toxicité d’une durée de sept jours qui mesurent les effets sur la croissance et la survie de têtes-de-boule (Pimephales promelas) au stade larvaire. Il s’agit d’une version révisée du rapport SPE 1/RM/22 qui comprend plusieurs éléments nouveaux, comme l’utilisation d’analyses de régression pour les résultats quantitatifs, ainsi que l’emploi du paramètre « biomasse » pour obtenir une mesure combinée des effets sur la survie et la croissance, comme le fait l’EPA des États-Unis (2002) dans son essai de détermination des effets toxiques sur la survie et la croissance des larves de tête-de-boule d’une durée de sept jours. Après sa publication par l’Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canada [Ottawa (Ontario)], cette méthode révisée remplacera la méthode décrite dans le rapport SPE 1/RM/22 d’Environnement Canada qui a été publié en février 1992 et modifié à deux reprises (soit en novembre 1997 et septembre 2008).

Ce document présente des modes opératoires pour l’élevage de têtes-de-boule en laboratoire, l’obtention d’œufs et l’éclosion de larves devant servir aux essais. Il présente les conditions et modes opératoires généraux ou universels permettant de réaliser des essais sur un large éventail de matières ou de substances pour déterminer leur effet sur la croissance et sur la mortalité des larves. On y précise aussi d’autres conditions et modes opératoires propres à l’évaluation d’échantillons de produits chimiques, d’effluents, d’élutriats, de lixiviats ou de milieux récepteurs. Le lecteur y trouvera des instructions et des exigences concernant les installations d’essai, la manipulation et le stockage des échantillons, la préparation des solutions d’essai et la mise en route des essais, les conditions prescrites pour les essais, les observations et mesures appropriées, les résultats des essais, les méthodes de calcul et l’utilisation de produits toxiques de référence.

Avant-propos

Le présent document fait partie d’une collection de méthodes recommandées pour mesurer et évaluer l’effet ou les effets toxiques de l’exposition d’une espèce particulière d’organisme aquatique ou terrestre à des échantillons de substances ou de matières toxiques ou susceptibles d’être toxiques dans des conditions de laboratoire contrôlées et définies. Environnement Canada a évalué ces méthodes et en préconise l’emploi :

  • dans ses laboratoires d’écotoxicité;
  • pour les essais qu’il donne en sous-traitance ou qui lui sont demandés par d’autres organismes ou des entreprises;
  • en l’absence d’instructions plus précises, comme dans les règlements;
  • comme base pour l’établissement d’instructions très explicites comme celles qui pourraient être requises dans un protocole réglementaire ou une méthode de référence normalisée.

Les différents types d’essais compris dans cette collection ont été choisis parce qu’ils répondent aux besoins des programmes de protection et de gestion de l’environnement mis en œuvre par Environnement Canada. Les documents de la collection visent à fournir des lignes directrices et à faciliter l’utilisation de méthodes cohérentes, pertinentes et exhaustives pour recueillir les données sur la toxicité pour les organismes aquatiques ou terrestres d’échantillons de substances ou de matières qui sont destinées à être dispersées dans l’environnement ou présentes dans l’environnement. Selon la ou les méthodes d’essai biologique choisies et le milieu naturel visé, les substances ou matières dont la toxicité doit être mesurée pourraient comprendre des échantillons d’une substance ou d’un produit chimique, d’un effluent, d’un élutriat, d’un lixiviat, d’un milieu récepteur, d’un sédiment ou d’une matière particulaire semblable, ou encore d’un sol ou d’une matière particulaire semblable. On trouvera à l’annexe F du présent document la liste des méthodes d’essai biologique et des documents connexes déjà publiés par Environnement Canada dans le cadre de cette collection.

Les termes définis dans la section « Terminologie » figurent en italique lorsqu’ils sont utilisés pour la première fois dans le texte conformément à la définition qui en est donnée. L’italique est également employé pour mettre en évidence ces termes et certains autres dans le rapport.

Liste des abréviations et des formules chimiques

ANOVA
analyse de variance
°C
degré Celsius
CaCO3
carbonate de calcium
CIp
concentration inhibitrice pour un pourcentage d’effet (précisé)
CL
concentration létale
CL50
concentration létale 50
cm
centimètre
CMEO
concentration minimale avec effet observé
CSEO
concentration sans effet observé
C.V
coefficient de variation
d
jour
g
gramme
g/kg
gramme par kilogramme
h
heure
HCl
acide chlorhydrique
H2O
eau
L
litre
m
mètre
MC
marque de commerce
mg
milligramme
min
minute
mL
millilitre
mm
millimètre
mS
millisiemens
N
normal
NaOH
hydroxyde de sodium
nm
nanomètre
OD
oxygène dissous (concentration)
P
probabilité
s
écart type
SI
Système international d’unités
sp
espèce
TL50
temps létal 50
µg
microgramme
µmhos
micromhos
µmol
micromole
µm
micromètre
>
supérieur à
<
inférieur à
supérieur ou égal à
inférieur ou égal à
±
plus ou moins
%
pour cent
pour mille
/
par; peut aussi signifier « ou » (p. ex., eau témoin/de dilution)

Glossaire

Remarque:   Toutes les définitions ci-après s’appliquent aux méthodes énoncées dans le présent rapport; il se pourrait qu’elles ne soient pas adaptées à d’autres contextes.

Verbes auxiliaires

L’auxiliaire doit (doivent) est utilisé pour exprimer une obligation absolue.

L’auxiliaire devrait (devraient) et le conditionnel d’obligation(il faudrait, etc.) sont utilisés pour indiquer que la condition ou la méthode en question est recommandée et doit être respectée dans la mesure du possible.

L’auxiliaire peut (peuvent) indique qu’on est autorisé à faire une chose ou en mesure de la faire.

L’auxiliaire pourrait (pourraient) indique la possibilité ou l’éventualité.

Termes techniques généraux

Acclimatation - Adaptation physiologique à un niveau précis d’une ou de plusieurs variables environnementales, par exemple la température. Ce terme s’applique généralement à l’ajustement à des conditions contrôlées en laboratoire.

Conductivité - Expression numérique de la capacité d’une solution aqueuse de transporter un courant électrique. Cette capacité dépend de la concentration, de la valence et de la mobilité des ions en solution, ainsi que de la température de la solution. La conductivité se mesure à 25°C et s’exprimeen millisiemens par mètre (unité SI), ou en micromhos par centimètre (1 mS/m = 10 µmhos/cm).

Conformité - Respect des règlements ou des exigences gouvernementales en matière de permis.

Croissance - Accroissement de taille ou gain de poids résultant de la prolifération de nouveaux tissus. Dans le présent document, le sens de ce terme est limité à l’accroissement du poids sec.

Dispersant- Substance chimique qui réduit la tension superficielle entre l’eau et une substance ou matière hydrophobe (p. ex., du pétrole), ce qui facilite la dispersion de cette substance ou matière dans l’eau sous forme d’émulsion.

Dureté - Concentration, dans l’eau, de cations réagissant avec une solution savonneuse de sodium pour entraîner la précipitation d’un résidu insoluble. En règle générale, la dureté correspond à la concentration d’ions de calcium et de magnésium dans l’eau et s’exprime en mg/L de carbonate de calcium ou l’équivalent.

Élevage - Ensemble des animaux qu’on élève dans des conditions définies et contrôlées pendant une génération ou plus afin d’obtenir des organismes sains en vue d’essais. Activité visant à obtenir de tels stocks d’animaux.

Embryon - Jeune poisson non développé, avant son éclosion de l’oeuf. Dans les documents relatifs à la tête-de-boule, on parle généralement d’« embryon » plutôt que d’« oeuf ».

Émulsifiant - Substance chimique qui facilite le mélange fin (sous forme de minuscules gouttelettes), dans l’eau, d’une substance normalement hydrophobe.

Floculation - Formation d’un précipité léger en suspension (floc) dans une solution.

Larve - Poisson récemment éclos qui possède des caractéristiques physiques différentes de celles observées chez le poisson adulte. La période larvaire commence avec l’éclosion de l’embryon et dure jusqu’à la disparition du dernier vestige du repli de nageoire médian et à l’apparition de l’ensemble complet des épines et des rayons des nageoires. On considère que les têtes-de-boule sont larvaires pendant les quelques jours qui suivent leur éclosion.

Lot - Groupe unique d’embryons ou de jeunes larves (écloses depuis pas plus de 24 heures) prélevé dans un élevage, à un moment donné, afin de fournir tous les organismes destinés à être utilisés dans un essai donné de toxicité (y compris dans tout essai connexe de toxicité de référence). Les embryons ou larves d’un lot proviennent normalement d’au moins trois pontes (c’est-à-dire de géniteurs différents).

Lux - Unité SI d’éclairement, mesurant l’intensité lumineuse par mètre carré. 1 lux = 0,0929 pied-bougie et 1 pied-bougie = 10,76 lux. Pour convertir le nombre de lux en valeur du flux quantique [μmol/(m2 · s)], il faut connaître la qualité spectrale de la source lumineuse. Les conditions de luminosité ou l’irradiance sont décrites adéquatement par le flux quantique (débit de fluence photonique) dans la gamme des longueurs d’onde photosynthétiquement efficaces, d’environ 400 à 700 nm. Le rapport entre le flux quantique et le nombre de lux (ou pieds-bougies) varie énormément en fonction de la source lumineuse, de l’appareil de mesure de la lumière utilisé, de la disposition géométrique et des réflexions possibles (cf. ASTM, 1999). Dans le cas des fluorescents à spectre complet (p. ex., Vita-Lite® par Duro-Test®), une conversion approximative est obtenue en considérant que 1 lux équivaut approximativement à 0,016 μmol/(m2 · s) [Deitzer, 1994; Sager et McFarlane, 1997].

Méthode de référence - Protocole conçu spécifiquement pour la réalisation d’un essai de toxicité, c’est-à-dire une méthode d’essai biologique comportant un ensemble explicite de modes opératoires et de conditions d’essai, exposé avec précision dans un document écrit et dont sont convenues formellement les parties en cause. Contrairement à d’autres méthodes d’essai biologique polyvalentes (génériques) publiées par Environnement Canada, les méthodes de référence sont souvent réservées à des essais associés à des règlements particuliers.

Nauplius - Stade larvaire le plus précoce caractéristique de nombreux crustacés marins et de certains autres invertébrés. Le nauplius est microscopique, nage librement et ne possède que trois paires d’appendices et un oeil médian à l’avant de la tête.

pH - Logarithme négatif de l’activité des ions d’hydrogène, mesurée par leur concentration en moles par litre. Cette valeur exprime le degré ou l’intensité des réactions acides et alcalines selon une échelle de 0 à 14, où le nombre 7 représente la neutralité et les nombres inférieurs correspondent, en ordre décroissant, à des réactions acides de plus en plus fortes; les chiffres supérieurs à 7 indiquent, en ordre croissant, des réactions basiques ou alcalines de plus en plus fortes.

Photopériode - Durée d’éclairage et d’obscurité au cours d’un cycle de 24 h.

Pourcentage (%)- Concentration exprimée en parties par centaine. Un pour cent représente une unité ou partie d’une matière ou substance (p. ex., produit chimique, effluent, élutriat, lixiviat ou milieu récepteur) diluée dans de l’eau, jusqu’à concurrence de 100 parties. On peut préparer des concentrations en volume (V/V), ou en masse (m/m). On les exprime en pourcentage de la substance ou de la matière à expérimenter dans la solution finale.

Précipitation - Formation d’un solide (précipité) à partir d’une partie ou de la totalité des constituants dissous d’une solution.

Prétraitement - Dans le présent rapport, traitement d’un échantillon ou de sa dilution avant l’exposition des poissons.

Protocole - Document exposant avec précision l’ensemble des étapes à suivre pendant un essai et dont sont convenues formellement les parties en cause.

Salinité - Quantité totale, en grammes, de solides dissous dans 1 kg d’eau de mer. Elle se détermine après conversion de tous les carbonates en oxydes, après remplacement de tous les bromures et iodures par des chlorures et après oxydation de toutes les matières organiques. La salinité peut aussi se mesurer directement grâce à un salinimètre/conductimètre ou par d’autres moyens (cf. APHA et al., 1989 et 2005). Elle s’exprime habituellement en grammes par kilogramme (g/kg) ou en parties par millier (‰).

Surveillance - Activités de vérification de la qualité ou de collecte et de communication de données, effectuées de façon régulière (p. ex., quotidienne, hebdomadaire, mensuelle ou trimestrielle). Dans le contexte du présent rapport, ce terme s’applique soit à la vérification et à la mesure périodiques de certaines variables biologiques ou relatives à la qualité de l’eau, soit au prélèvement et à l’essai d’échantillons d’effluents, d’élutriats, de lixiviats ou de milieux récepteurs pour la mesure de leur toxicité.

Turbidité - Degré de réduction de la clarté de l’eau par la présence de matières en suspension ou autres qui entraînent la diffusion et l’absorption de la lumière, plutôt que sa transmission en ligne droite dans l’échantillon. La turbidité s’exprime généralement en unités de turbidité néphélométrique.

Termes relatifs aux matières ou substances servant aux essais

Eau d’amont - Eau de surface (p. ex., d’un ruisseau, d’une rivière ou d’un lac) qui n’est pas soumise à l’influence d’un effluent (ou d’une autre matière ou substance à expérimenter), du fait qu’elle se trouve par rapport à lui dans une direction opposée au courant ou assez loin perpendiculairement au courant.

Eau de dilution - Eau utilisée pour diluer la substance ou la matière à expérimenter afin d’en préparer différentes concentrations en vue des divers traitements prévus dans le cadre des essais de toxicité.

Eau déchlorée - Eau chlorée (généralement, eau potable municipale) qu’on a traitée afin d’en éliminer le chlore et ses composés.

Eau désionisée - Eau qu’on a purifiée pour en extraire les ions en la faisant circuler dans des colonnes de résine ou dans un système d’osmose inverse.

Eau distillée - Eau qu’on a traitée au moyen d’un appareil de distillation (au verre borosilicaté ou autre) pour en éliminer les impuretés.

Eau reconstituée - Eau désionisée ou distillée dans du verre à laquelle des produits chimiques de qualité « réactif » ont été ajoutés. L’eau douce synthétique qui en résulte est exempte de contaminants et possède le pH et la dureté souhaités.

Eau témoin/de dilution - Eau utilisée comme témoin, pour diluer la substance à expérimenter ou pour l’une et l’autre de ces fins.

Eaux usées - Terme général englobant les effluents, les lixiviats et les élutriats.

Effluent - Tout déchet liquide (p. ex., industriel ou urbain) rejeté dans l’environnement aquatique.

Élutriat - Solution aqueuse obtenue après avoir ajouté de l’eau à un déchet solide (p. ex., sédiments, stériles ou boues de forage ou de dragage), avoir agité le mélange, puis l’avoir centrifugé ou filtré ou avoir décanté le surnageant.

Essai de toxicité de référence - Essai effectué à l’aide d’un produit toxique de référence, parallèlement à un essai définitif de toxicité sur une matière ou une substance donnée à expérimenter, afin d’évaluer la sensibilité des organismes ainsi que la précision et la fiabilité des résultats obtenus par le laboratoire pour cette substance de référence au moment où l’on évalue la matière ou la substance à expérimenter. Toute déviation par rapport à une plage normale préétablie indique que la sensibilité des organismes d’essai ainsi que l’exécution et la précision de l’essai sont suspectes.

Lixiviat - Eau ou eau usée ayant traversé une colonne de sol ou de déchets solides dans l’environnement.

Matière - Substance ou ensemble de substances dont est faite une chose. Elle a des caractéristiques qui sont plus ou moins uniformes. Les effluents, les lixiviats, les élutriats et les eaux de surface sont des matières. Ordinairement, une matière contient plusieurs ou de nombreuses substances.

Milieu récepteur - Eau de surface (p. ex., d’un ruisseau, d’une rivière ou d’un lac) qui a reçu un rejet de déchet ou qui est sur le point d’en recevoir un (p. ex., immédiatement en amont du point de rejet). D’autres termes doivent être employés afin de préciser lequel de ces deux sens s’applique dans le contexte.

Produit chimique - Dans le présent rapport, se dit de tout élément, composé, formule ou mélange de substances chimiques qui pourrait se retrouver dans l’environnement aquatique par déversement, application ou rejet. Les insecticides, les herbicides, les fongicides, les larvicides employés contre la lamproie marine et les agents de traitement des déversements de pétrole sont des exemples de produits chimiques qui se retrouvent dans l’environnement.

Produit toxique de référence - Produit chimique étalon utilisé pour mesurer la sensibilité des organismes soumis à l’essai afin d’établir les limites de confiance des données de toxicité recueillies sur une matière ou substance à expérimenter. Dans la plupart des cas, on procède à un essai de toxicité sur un produit toxique de référence afin d’évaluer la sensibilité des organismes au moment de l’étude d’une matière ou substance à expérimenter, ainsi que la précision des résultats obtenus par le laboratoire pour ce produit.

Solution mère - Solution aqueuse concentrée de la substance ou de la matière à expérimenter. Des volumes mesurés de la solution mère sont ajoutés à l’eau de dilution afin de préparer les solutions d’essai aux concentrations requises.

Substance - Matière particulière ayant des propriétés plus ou moins uniformes. Le terme a un sens plus restreint que matière et pourrait désigner une substance chimique (p. ex., un élément) ou un produit chimique.

Témoin - Traitement reproduisant l’ensemble des conditions et facteurs qui pourraient influencer les résultats d’une enquête ou d’une étude, à l’exception de la condition particulière faisant l’objet de cette étude. Dans un essai de toxicité, le témoin doit reproduire toutes les conditions du ou des traitements d’exposition en l’absence de la substance ou de la matière contaminée à expérimenter. Le témoin sert à vérifier l’absence de toxicité mesurable attribuable à des conditions de base de l’essai (p. ex., qualité de l’eau de dilution et santé ou manipulation des organismes soumis à l’essai). Ce terme est également employé pour désigner les organismes soumis à ce traitement.

Termes relatifs à la statistique et à la toxicologie

Aigu - Qui se manifeste au cours d’une courte période d’exposition par rapport à la durée de la vie de l’organisme, généralement quatre jours ou moins dans le cas des poissons. Un effet toxique aigu serait provoqué et observable au cours de cette période.

Biomasse - Aux fins de cette méthode d’essai, le poids (sec) total de poissons vivants à la fin de l’essai dans un récipient d’essai, divisé par le nombre de larves dans le récipient au début de l’essai. Le résultat pour le paramètre de la biomasse est représentatif à la fois de l’effet sublétal et de la mortalité.

Chronique - Qui a lieu dans un intervalle d’exposition relativement prolongé correspondant généralement à une partie importante de la durée de la vie de l’organisme, par exemple 10 % ou plus.

CIp - Concentration inhibitrice pour un pourcentage d’effet donné (précisé). Il s’agit d’une estimation ponctuelle de la concentration à laquelle la substance ou la matière à expérimenter provoque une réduction d’un pourcentage donné d’une fonction biologique de caractère quantitatif, comme la croissance du poisson. Par exemple, une CI25 pourrait être la concentration qui causerait une réduction de 25 % de la croissance des larves de poisson soumises à l’essai, par rapport à la croissance des témoins (y compris celle révélée par la biomasse). Cette expression devrait être appliquée à tout essai toxicologique qui sert à mesurer la variation d’une mesure relative, comme le taux de reproduction, la vitesse de croissance (y compris celle mesurée et exprimée en fonction de la biomasse) ou l’activité respiratoire. (L’expression CE50, ou concentration efficace 50 ou concentration efficace médiane, ne s’emploie que pour des mesures absolues, comme le nombre de sujets chez lesquels on observe un effet particulier.)

CL50 - Concentration létale 50 (ou médiane). Il s’agit de la concentration d’une substance ou d’une matière dans l’eau qu’on estime létale pour 50 % des organismes soumis à l’essai. La CL50 et ses limites de confiance à 95 % sont généralement obtenues par analyse statistique de la mortalité à plusieurs concentrations d’essai, après une durée d’exposition donnée. Cette durée doit être précisée (p. ex., la CL50 après sept jours).

CMEO - Concentration minimale avec effet observé. Il s’agit de la plus faible concentration d’une matière ou substance à expérimenter qui, lorsque des organismes y sont exposés, provoque chez eux des effets nocifs qui sont détectés par l’observateur et sont statistiquement significatifs. Par exemple, la CMEO pourrait être la plus faible concentration à laquelle la croissance de poissons soumis à l’essai diffère significativement de celle d’organismes témoins.

Coefficient de variation (C.V.) - Écart type divisé par la moyenne d’un ensemble de données. S’exprime sous la forme d’un pourcentage. La formule utilisée pour le calculer est : C.V. (%) = 100 (écart type ÷ moyenne).

CSEO - Concentration sans effet observé. Il s’agit de la plus forte concentration d’une matière ou d’une substance qui, lorsque des organismes y sont exposés, ne provoque chez eux aucun effet nocif observé statistiquement significatif. Par exemple, la CSEO pourrait être la plus forte concentration d’essai à laquelle la croissance de poissons soumis à l’essai ne diffère pas significativement de celle d’organismes témoins. La CSEO s’applique habituellement aux effets sublétaux et, sauf indication contraire, au plus sensible d’entre eux.

Diagramme de contrôle - Graphique servant à suivre l’évolution des effets mesurés d’un produit toxique de référence. Sur l’axe horizontal est portée la date de l’essai, et sur l’axe vertical, à échelle logarithmique, la concentration à laquelle un effet est observé.

Essai à renouvellement continu - Essai de toxicité pendant lequel les solutions des réservoirs d’essai sont renouvelées en continu par l’apport constant d’une solution fraîche ou par un apport intermittent fréquent.

Essai à renouvellement périodique - Essai de toxicité pendant lequel les solutions d’essai sont renouvelées (remplacées) périodiquement, généralement à intervalles de 24 h. Synonymes : « essai à renouvellement intermittent », « essai statique avec renouvellement », « essai semi-statique ».

Essai statique - Essai de toxicité pendant lequel les solutions d’essai ne sont pas renouvelées.

Essai toxicologique ou essai de toxicité - Détermination de l’effet d’une substance ou d’une matière sur un groupe d’organismes choisis, dans des conditions définies. Un essai de toxicité en milieu aquatique permet généralement de mesurer par suite de l’exposition à des concentrations particulières d’une substance chimique, d’un effluent, d’un élutriat, d’un lixiviat ou d’un milieu récepteur, selon le cas : a) la proportion des organismes atteints (effet quantique); b) l’intensité de l’effet observé (effet gradué ou quantitatif).

Évaluation d’identification de la toxicité - Prétraitement systématique d’un échantillon (p. ex., ajustement du pH, filtration, aération), suivi d’un essai de toxicité. Cette évaluation permet de définir les agents qui sont les principaux responsables de la toxicité dans un mélange complexe. L’essai de toxicité peut être létal ou sublétal.

Homoscédasticité - Dans le présent document, se dit de données dont le diagramme de dispersion se caractérise par une homogénéité des résidus. Il y a homoscédasticité lorsque la variabilité des résidus ne change pas significativement par rapport à la variable indépendante (c.-à-d. en fonction des concentrations d’essai ou des niveaux de traitement). Lorsqu’on effectue les analyses statistiques et qu’on évalue les résidus (p. ex., en appliquant le test de Levene), dans le cas de données d’essai affichant une homoscédasticité (c.-à-d. une homogénéité des résidus), on n’observe pas de différence significative dans la variance des résidus en fonction des concentrations d’essai ou des traitements.

Hormèse - Phénomène par lequel de faibles concentrations de la matière ou de la substance à expérimenter stimulent la performance des organismes d’essai par rapport aux organismes témoins (autrement dit, on observe une hausse et une « amélioration » de la performance à une ou plusieurs concentrations faibles par comparaison au traitement témoin). Aux concentrations supérieures, on constate des effets nuisibles.

Létal - Qui entraîne la mort par action directe. Dans le cas de poissons, on entend par « mort » la cessation de tous les signes visibles de mouvement ou d’activité.

Létalité aiguë - Propriété d’une substance ou matière de causer la mort des organismes d’essai au cours d’une brève période d’exposition, ordinairement 96 h dans le cas des poissons.

Limite de contrôle de 95% - Limite, calculée logarithmiquement, située à plus ou moins deux écarts types de part et d’autre de la moyenne géométrique historique des résultats des essais de toxicité portant sur un produit toxique de référence.

Moyenne géométrique - Moyenne de mesures répétées, calculée logarithmiquement. Elle a pour avantage d’atténuer l’influence qu’exercent les valeurs extrêmes sur la moyenne, par comparaison à la moyenne arithmétique. On peut la déterminer en calculant la racine n-ième du produit des n valeurs des mesures, ou l’antilogarithme de la moyenne des logarithmes des n valeurs.

Normalité (ou distribution normale) - Désigne une série de données d’observation dont la distribution est symétrique, en forme de cloche. La série met en correspondance la fréquence d’occurrence et la valeur de la variable mesurée. Dans une distribution normale, la plupart des observations sont groupées autour de la valeur moyenne, et leur nombre diminue progressivement à mesure qu’on s’approche des extrêmes de la plage des valeurs. La distribution normale joue un rôle central dans la théorie statistique en raison de ses propriétés mathématiques. Elle revêt également une grande importance dans les sciences biologiques du fait qu’elle se retrouve dans beaucoup de phénomènes biologiques. Comme de nombreux tests statistiques reposent sur l’hypothèse d’une distribution normale des données, il peut être nécessaire de vérifier que cette condition est remplie pour des ensembles particuliers de données.

Paramètre - Mesure ou valeur (il peut y en avoir plus d’une) caractérisant les résultats d’un essai.

Précision - Degré de rapprochement des résultats de mesures répétées d’une même quantité. La précision décrit le degré de certitude concernant un résultat, ou le rapprochement des valeurs d’un paramètre déterminé statistiquement, comme la CIp.

Quantique - Adjectif utilisé dans des expressions comme « données quantiques » et « essai quantique ». Un effet quantique est un effet qui est soit manifesté ou non manifesté par un organisme d’essai. Par exemple, un animal peut soit vivre soit mourir, ou il peut se développer normalement ou anormalement. En général, les effets quantiques sont exprimés sous la forme d’un nombre ou d’un pourcentage.

Quantitatif - Adjectif utilisé dans des expressions comme « données quantitatives » et « essai quantitatif ». Un effet quantitatif est un effet dont la valeur mesurée peut être un nombre entier ou fractionnaire sur une échelle numérique. Il peut s’agir, par exemple, du nombre de descendants produits ou du poids atteint par chaque organisme à la fin d’un essai.

Répétition (récipient d’essai) - Enceinte expérimentale individuelle renfermant un nombre prescrit d’organismes ainsi qu’une concentration de la matière ou de la substance identique à celle du ou des traitements témoinsou traitements de référence. Comme il s’agit d’une unité expérimentale indépendante, tout transfert d’organisme ou de matière d’essai d’un récipient d’essai à un autre invaliderait l’analyse statistique fondée sur la répétition.

Résultat- Mesure ou valeur (il peut y en avoir plus d’une) obtenue lors d’un essai (p. ex., CL50 et CI25). La réaction des organismes d’essai (comme la mort ou la biomasse des organismes vivants) représente également un résultat.

Sublétal - Qui a un effet néfaste sur l’organisme, mais en deçà de la concentration ou du niveau de contamination qui entraîne directement la mort pendant la durée de l’essai.

TL50 - Temps létal 50 (ou médian). Il s’agit de la durée d’exposition qui causerait 50 % de mortalité au sein d’un groupe de poissons détenus dans une solution d’essai particulière. Cette valeur est estimée par une représentation graphique puisqu’il n’existe pas de technique informatique ou mathématique normalisée qui soit d’usage courant (cf. annexe E).

Toxicité - Capacité intrinsèque d’une substance ou d’une matière de provoquer des effets nocifs chez des organismes vivants. Ces effets pourraient être létaux ou sublétaux.

Toxicité chronique - Effets à long terme liés à des modifications d’éléments tels que le métabolisme, la croissance, la reproduction, la survie ou l’aptitude à la survie.

Toxique - Adjectif qualifiant une substance ou une matière qui peut avoir des effets nocifs sur des organismes vivants si elle se trouve en une quantité suffisante à un endroit propice. Nom employé comme synonyme de substance ou matière toxique.

Traitement - En règle générale, intervention ou procédure dont l’effet doit être mesuré. Plus précisément, dans un essai toxicologique, un traitement est une condition ou procédure que l’expérimentateur applique à des organismes d’essai afin d’en mesurer les effets sur eux. Le traitement peut consister en une concentration donnée d’une matière ou d’une substance potentiellement toxique. Il peut aussi s’agir d’une matière d’essai en particulier (p. ex., un échantillon d’effluent, d’élutriat, de lixiviat, de milieu récepteur ou d’eau témoin).

Remerciements

En février 1992, Environnement Canada a publié le rapport SPE 1/RM/22 « Méthode d’essai biologique : essai de croissance et de survie sur des larves de tête-de-boule ». Ce rapport, qui a été modifié en novembre 1997 et de nouveau en septembre 2008 en tenant compte des révisions précédentes, avait été rédigé conjointement par J.B. Sprague [Sprague Associates Ltd., Guelph (Ontario)] et D.J. McLeay [McLeay Associates Ltd., West Vancouver (C.-B.)]. Il était basé sur des rapports préexistants décrivant un essai, d’une durée de sept jours, pour la mesure de la survie et de la croissance de larves de tête-de-boule, qui avait été utilisé aux États-Unis (Norberg et Mount, 1985; Denny, 1987; EPA, 1989), ainsi qu’en Ontario par C.M. Neville (1989), du ministère de l’Environnement de l’Ontario. G.A. Sergy et R.P. Scroggins (Protection de l’environnement, Conservation et Protection, Environnement Canada) avaient fait fonction de responsables scientifiques et apporté leur collaboration et leurs conseils techniques à la préparation du rapport. Les membres de 1991 du Groupe intergouvernemental sur la toxicité aquatique (renommé « Groupe intergouvernemental sur les essais écotoxicologiques »; cf. annexe A pour la liste des membres en 2009) avaient participé activement à l’élaboration et à l’examen de la première édition du document. Les équipes des laboratoires d’essai du ministère de l’Environnement de l’Ontario à Rexdale (Ont.) et d’Environnement Canada (cf. annexe B) avaient également contribué à la préparation du rapport.  Nous aimerions remercier Richard Chong-Kit du Ministère de l’environnement de l’Ontario pour les photos sur la couverture. 

Le présent rapport est une version révisée et actualisée du rapport SPE 1/RM/22 (incluant les modifications apportées en novembre 1997 et en mars 2008). Il a été préparé par D. McLeay [McLeay Environmental Ltd., Victoria (C.-B.)] avec l’aide et les conseils de L. Taylor (gestionnaire, Unité de l’élaboration et de l’application des méthodes) et de R. Scroggins (chef, Section des méthodes biologiques) d’Environnement Canada, à Ottawa (Ontario).

Section 1 Introduction

1.1 Contexte

Au Canada et ailleurs, on se sert d’essais de toxicité en milieu aquatique pour mesurer, prévoir et contrôler le rejet de substances ou de matières potentiellement nocives pour les organismes aquatiques. On ne peut s’attendre à ce qu’un seul organisme ou une seule méthode d’essai réponde aux besoins d’une démarche globale en matière de conservation et de protection de l’environnement. C’est pourquoi, il y a deux décennies, le Groupe intergouvernemental sur les essais écotoxicologiques (cf. annexe A) a proposé une série d’essais de toxicité en milieu aquatique qui seraient généralement acceptables et qui permettraient de mesurer différents types d’effets toxiques chez des organismes représentatifs de différents niveaux trophiques et groupes taxinomiques (Sergy, 1987). Un essai mesurant la croissance et la mortalité de larves de tête-de-boule est l’un des essais de toxicité en milieu aquatique qu’on a alors choisi de normaliser de sorte qu’il permette de respecter les exigences d’Environnement Canada en matière d’essais.

En février 1992, Environnement Canada a publié un rapport (SPE 1/RM/22) présentant un essai d’une durée de sept jours pour mesurer les effets toxiques de contaminants de l’environnement sur la croissance et la survie des larves de tête-de-boule (EC, 1992). La méthode d’essai a été modifiée en novembre 1997 et de nouveau en septembre 2008. Le présent rapport constitue une version révisée et actualisée du rapport SPE 1/RM/22 (incluant les modifications antérieures et les révisions appropriées). Après sa publication, la méthode d’essai biologique présentée dans le présent rapport annulera et remplacera les instructions antérieures d’Environnement Canada contenues dans la version modifiée (à deux reprises) du rapport SPE 1/RM/22 (1992) pour l’exécution d’un essai de sept jours portant sur la croissance et la survie de larves de tête-de-boule.

Dans la présente version modifiée et actualisée du rapport d’Environnement Canada SPE 1/RM/22 (2010; incluant les modifications de novembre 1992 et de septembre 2008), on décrit des modes opératoires universels qui s’appliquent à tout essai sur les larves de tête-de-boule mené en laboratoire. On présente également des ensembles particuliers de conditions et de modes opératoires, prescrits ou recommandés, pour l’application de cet essai à l’évaluation de différents types de substances ou matières (à savoir des échantillons de produit chimique, d’effluent, d’élutriat, de lixiviat ou de milieu récepteur; cf. figure 1). Les modes opératoires et les conditions applicables à la conduite de l’essai sont définis et, au besoin, expliqués dans des notes en bas de page. En élaborant ces conditions et modes opératoires, on s’est efforcé de mettre en balance les considérations scientifiques, pratiques et financières, en plus de veiller à ce que les résultats soient assez exacts et précis pour la majorité des cas d’application. Le présent document ne renferme pas d’instructions explicites comme celles qui pourraient s’avérer nécessaires dans une méthode de référence ou un protocole réglementaire; néanmoins, il est destiné à servir de document d’orientation pour cette application et d’autres utilisations.

Cette version révisée et actualisée du rapport SPE 1/RM/22 définit et utilise un paramètre fondé sur la « biomasse » (cf. sous-section 4.5) comme mesure de la combinaison des effets toxiques sur la survie et la croissance des larves du poisson. Ce paramètre fournit un résultat plus sensible et écologiquement pertinent que le paramètre plus strict de l’effet sublétal sur la croissance (reposant sur le poids sec moyen atteint par les poissons qui survivent) qui était considéré antérieurement, selon les instructions du rapport SPE 1/RM/22 (EC, 1992; jusqu’aux modifications de novembre 1997 inclusivement). L’utilisation du paramètre fondé sur la biomasse concorde avec l’approche appliquée par l’Environmental Protection Agency (EPA) aux États-Unis dans sa méthode d’estimation de la toxicité chronique d’effluents ou de milieux récepteurs par détermination de la survie et de la croissance de larves de tête-de-boule dans un essai de sept jours (EPA, 2002, section 11). Comme dans les modifications de septembre 2008 (EC, 1992), le présent rapport inclut des instructions visant l’utilisation de statistiques révisées (c.-à-d. d’analyses de régression) pour le calcul du résultat statistique (c.-à-d. la CIp; cf. 4.5.1) à partir des calculs de la biomasse dans le cas d’un essai à plusieurs concentrations.

Figure 1 Schéma de la démarche adoptée pour définir les conditions et modes opératoires adaptés à différents types de matières ou de substances

Modes opératoires universels

  • Obtention des embryons et des larves de poissons
  • Élevage des poissons
  • Préparation des solutions d’essai
  • Produits toxiques de référence
  • Conditions de l’essai (pH, OD, etc.)
  • Mise en route de l’essai
  • Mesures de la qualité de l’eau
  • Observations pendant l’essai
  • Résultats de l’essai
  • Calculs
  • Validité des résultats
  • Considérations d’ordre juridique

Éléments traités dans des sections particulières

Produits chimiques

  • Choix de l’eau témoin/de dilution
  • Préparation des solutions
  • Observations pendant l’essai
  • Mesures pendant l’essai
  • Résultats
  • Propriétés chimiques
  • Étiquetage et stockage
  • Mesures chimiques

Effluents, lixiviats et élutriats

  • Choix de l’eau témoin/de dilution
  • Préparation des solutions
  • Observations pendant l’essai
  • Mesures pendant l’essai
  • Résultats
  • Contenants et étiquetage
  • Transport et stockage des échantillons

Milieux récepteurs

  • Choix de l’eau témoin/de dilution
  • Préparation des solutions
  • Observations pendant l’essai
  • Mesures pendant l’essai
  • Résultats
  • Contenants et étiquetage
  • Transport et stockage des échantillons

1.2 Description de l’espèce et utilisation antérieure pour des essais

La tête-de-boule appartient à la famille des cyprinidés, regroupant les carpes et les ménés, qui est la principale famille de poissons d’eau douce pour ce qui est du nombre d’espèces. On dénombre 44 espèces de cette famille au Canada, la plupart d’entre elles étant des petits ménés d’apparence similaire à celle de la tête-de-boule. La longueur maximale de la tête-de-boule au Canada est de 8,3 à 9,4 cm, les femelles adultes étant plus petites et mesurant normalement de 4 à 7 cm (Andrews et Flicklinger, 1973; Scott et Crossman, 1973). Un poisson mâle de 7 cm pèse de 3,5 à 5 g, selon son état nutritionnel, et un poisson femelle de 5 à 6 cm pèse entre 1,5 et 2 g (Benoit et Carlson, 1977; Korver et Sprague, 1989). La tête-de-boule (Pimephales promelas) est un poisson indigène de la plupart des régions du Canada. Son aire de répartition touche les Territoires du Nord-Ouest (bassin versant méridional du Grand lac des Esclaves), couvre la majeure partie de l’Alberta, les deux tiers (au sud) de la Saskatchewan et du Manitoba, la majeure partie de l’Ontario (jusqu’à la baie d’Hudson), le sud-ouest du Québec et l’extrémité nord-ouest du Nouveau-Brunswick. Vers le sud, son aire de répartition se rétrécit dans la partie centrale des États-Unis et atteint le nord du Mexique (Scott et Crossman, 1973). Ce poisson ne se retrouve pas à l’ouest des Rocheuses ni dans les trois provinces les plus orientales de l’Atlantique, et il faudrait obtenir un permis avant de l’introduire dans un laboratoire de ces régions (cf. 2.2). La tête-de-boule prospère dans les étangs, les lacs, les fossés et les ruisseaux lents et boueux ainsi que dans les lacs alcalins ou salins comme ceux qu’on trouve en Saskatchewan. Il s’agit d’un poisson omnivore qui se nourrit de tout ce qu’il rencontre, des invertébrés vivants aux détritus, mais qui est bien adapté à un régime alimentaire à forte teneur en matières végétales.

La tête-de-boule commence à frayer en mai ou en juin dans la partie septentrionale de son aire de répartition, lorsque la température moyenne de l’eau n’est encore que de 13 à 17 °C. La température et la photopériode semblent jouer toutes deux un rôle dans le déclenchement du frai, qui peut se poursuivre durant tout l’été et prendre fin en août ou en septembre (Andrews et Flicklinger, 1973).

Durant le frai, la tête-de-boule mâle choisit un objet en saillie (rondin ou rocher), le nettoie et le défend ainsi que le territoire qui l’entoure. Les femelles sont autorisées à y pénétrer pour frayer sur la surface inférieure de l’objet; le mâle assure ensuite la garde et le nettoyage des oeufs. Le nettoyage est important car il empêche la croissance de champignons sur les oeufs. Une femelle peut produire entre 1 000 et 10 000 oeufs par saison, selon les conditions, et peut en déposer de 300 à 500 à la fois. Ces caractéristiques rendent cette espèce idéale pour les études en laboratoire, car le mâle adopte alors comme territoire de frai une section inversée d’une tuile semi-circulaire et l’expérimentateur peut facilement trouver et récupérer les embryons pour les compter ou pour obtenir de jeunes poissons. La tête-de-boule est en fait un bon poisson de laboratoire ou d’aquarium, qui s’acclimate facilement à ce mode de vie et s’adapte bien aux aliments séchés commerciaux pour poissons, aux artémias, etc. Cette espèce est couramment élevée dans des étangs aux États-Unis pour servir de poisson d’appât (Brauhn et al., 1975).

Aux États-Unis, la tête-de-boule sert à des essais de toxicité couvrant l’ensemble de son cycle biologique depuis les années 1960 (Mount et Stephan, 1967), et elle est à présent une espèce étalon pour les essais sur la létalité aiguë et les effets sublétaux ou chroniques (EPA, 1989, 1994 et 2002). Une banque de données toxicologiques d’une taille appréciable a été constituée pour cette espèce.

L’essai de sept jours sur les larves de poisson est un essai sublétal sensible, mais sa durée est courte par rapport à la durée de vie du poisson; il ne s’agit donc pas d’un essai chronique. Il pourrait ne pas permettre d’estimer avec exactitude les résultats d’expositions plus longues (Suter, 1990; Norberg-King, 1990). Cependant, il est sensible parce que le stade larvaire compte normalement parmi les stades les plus vulnérables de l’ensemble du cycle biologique (Woltering, 1984; McKim, 1985; Norberg et Mount, 1985; Suter et al., 1987; Norberg-King, 1989). En général (d’après les CSEO indiquées par Norberg-King, 1989Note de bas de page 1), on peut s’attendre à ce que l’essai de sept jours permette d’estimer avec une bonne exactitude la toxicité durant une exposition de 30 jours aux premiers stades du cycle biologique de la tête-de-boule; toutefois, dans certains cas, il peut exister un écart de deux fois, et on peut parfois constater des sous-estimations de l’ordre de dix fois. Par rapport à une exposition couvrant tout le cycle biologique de la tête-de-boule, l’essai de sept jours peut souvent sous-estimer la toxicité sublétale de deux ou trois fois, mais l’écart peut parfois aller jusqu’à 25 fois ou plus. L’essai sur les larves décrit dans le présent rapport ne remplace pas nécessairement les essais de toxicité chronique, mais, sur le plan des résultats, il se rapproche plus de ces essais que d’un essai de létalité classique sur de jeunes poissons (p. ex., Environnement Canada, 1990a).

Les résultats de l’essai de sept jours sur les larves ont montré une excellente corrélation avec les évaluations écologiques des eaux polluées. Dans une rivière du Kentucky, on a mis en évidence des coefficients de corrélation de 0,92 à 0,96 entre le taux de mortalité des larves de tête-de-boule et le nombre d’espèces de poissons résidant dans des sections du cours d’eau ainsi que le nombre d’espèces d’invertébrés et leur diversité (Birge et al., 1989). McKim (1985) justifie l’utilisation, pour les essais, de sujets aux premiers stades du cycle biologique et décrit ces stades.

La précision de l’essai de sept jours sur des larves de tête-de-boule a été jugée satisfaisante dans les comparaisons effectuées; par exemple, on a trouvé une comparaison approfondie de dix laboratoires américains (API, 1988), avec des coefficients de variation interlaboratoire de 31 % pour la survie des larves et de 52 % pour leur poids final. On a calculé un coefficient de variation de 31 % pour les résultats produits par neuf laboratoires de la région de San Francisco (Anderson et Norberg-King, 1991). Cette précision est supérieure à celle des analyses chimiques des polluants prioritaires, pour lesquelles on a obtenu un coefficient moyen de variation interlaboratoire d’au moins 60 % (Rue et al., 1988).

La tête-de-boule est utilisée dans plusieurs laboratoires canadiens de toxicité aquatique, tant gouvernementaux qu’industriels, pour des essais létaux et sublétaux. Une méthode d’essai normalisée a été décrite en Ontario (Neville, 1989), mais aucune méthode normalisée pour cette espèce n’avait été publiée jusqu’ici par un organisme du gouvernement fédéral canadien.

Aux États-Unis, plusieurs groupes ont décrit des méthodes normalisées pour des essais de toxicité sublétale, d’une durée de sept jours, portant sur la survie et la croissance de la tête-de-boule. Celle qui fait autorité émane de l’Environmental Protection Agency (EPA, 1989, 1994 et 2002); les autres descriptions produites sont pour l’essentiel des adaptations ou des versions abrégées de la méthode fondamentale de l’EPA (p. ex., Batelle, 1987; NJ, 1989).

Le présent document vise à définir une méthodologie canadienne normalisée pour l’évaluation de la toxicité sublétale de différentes substances ou matières au moyen d’un essai de sept jours sur des larves de tête-de-boule. Dans les méthodes d’essai que décrivent les documents américains, on rencontre certaines variations concernant les paramètres ou résultats, les pratiques telles que l’ajustement du pH, les méthodes à suivre compte tenu des divers objectifs poursuivis, les critères applicables à l’eau témoin/de dilution et la manière de traiter les échantillons qui contiennent des solides ou des matières en suspension en quantité appréciable. La méthode décrite dans le présent rapport est destinée à l’évaluation de la toxicité sublétale d’échantillons de produits chimiques, d’effluents, de lixiviats, d’élutriats ou de milieux récepteurs; on y justifie le choix de façons de procéder particulières.

Cette méthode fait appel à de l’eau douce comme eau témoin/de dilution; elle est conçue pour des sujets acclimatés à l’eau douce et porte sur des effluents, des lixiviats ou des élutriats essentiellement constitués d’eau douce (c.-à-d. d’une salinité maximale de 10 g/kg ) ou constitués d’eau salée mais destinés à être rejetés dans des eaux douces. On peut l’utiliser dans d’autres contextes, mais elle convient particulièrement lorsqu’il s’agit d’évaluer l’incidence réelle ou potentielle de matières ou de substances sur des milieux d’eau douce. Il existe d’autres essais, portant sur d’autres espèces acclimatées à l’eau de mer, qui peuvent permettre de déterminer l’incidence réelle ou potentielle de matières ou de substances dans des milieux estuariens ou marins, ou encore d’évaluer des eaux usées d’une salinité supérieure à 10 g/kg  qui doivent être rejetées dans de tels milieux.

Section 2 Organismes soumis à l’essai

2.1 Espèce et stade du cycle biologique

L’espèce servant aux essais est la tête-de-boule (Pimephales promelas). On doit utiliser pour les essais des larves écloses depuis 24 h au maximumNote de bas de page 2.

2.2 Source

La population destinée à la reproduction doit préférablement être acquise auprès d’un autre laboratoire possédant des poissons exempts de toute maladie (cf. 2.3.11). Le transfert d’embryons est la méthode qui pose le moins de risques de transmission de maladies et qui offre également la plus grande facilité sur le plan du transport. On peut aussi, ce qui est moins souhaitable, se procurer des poissons à l’état sauvage, mais il est alors nécessaire de procéder à un examen attentif afin de distinguer l’espèce recherchée des espèces similaires (Scott et Crossman, 1973). La présence de parasites et de maladies est probable chez les poissons sauvages; il faudrait donc les examiner attentivement, les élever en petits groupes isolés et attendre un cycle de reproduction complet avant de pouvoir utiliser la génération suivante pour des essais (Brauhn et al., 1975; Denny, 1987).

Un taxinomiste qualifié doit confirmer l’espèce des organismes d’essai reçus d’un fournisseur, et ce, au moins une fois pour chaque livraison de têtes-de-boule du fournisseur. Par la suite, une confirmation périodique de l’espèce peut être faite par le laboratoire d’essai en comparant un organisme d’un lot donné à un spécimen représentatif dont l’espèce a déjà été confirmée par un taxinomiste et qui a été préservé dans ce laboratoire (EC, 1999).

L’obtention, l’expédition et le transfert des poissons doivent être approuvés lorsque les autorités provinciales ou régionales l’exigent. Les gouvernements provinciaux pourraient exiger un permis pour l’importation de poissons ou de leurs oeufs, que l’espèce soit ou non indigène dans la région visée; en outre, les mouvements de stocks de poissons pourraient être régis par un comité fédéral-provincial des transplantations et des introductions d’espèces. Pour obtenir des conseils sur les sources de poissons et sur la manière d’entrer en contact avec le comité compétent ou avec les autorités provinciales, on peut communiquer avec les bureaux régionaux de la Protection de l’environnement (cf. annexe B). Dans les régions où la tête-de-boule n’est pas indigène [C.-B., I.-P.-É., T.-N., et certaines parties des autres provinces et territoires (cf. 1.2)], il faut faire une demande de permis auprès du comité mentionné ci-dessus, de l’organisme provincial compétent ou du directeur général régional du ministère des Pêches et Océans, selon la marche à suivre en vigueur localement.

Il est fortement recommandé d’obtenir les organismes d’essai (c’est-à-dire les larves qui ont éclos depuis 24 heures ou moins) d’un élevage sur place (cf. sous-section 2.3). Si, toutefois, c’est à l’extérieur qu’il faut obtenir les embryons ou les jeunes larves (écloses depuis pas plus de 24 heures) en vue d’un essai, il faudrait consulter les marches à suivre recommandées par Environnement Canada pour l’acquisition d’organismes destinés à des essais de toxicité sublétale (EC, 1999; consulter le document sur le site Web) et suivre les conseils qui y sont donnés.

S’il est nécessaire d’acquérir des organismes d’essai, il est recommandé que leur transport se fasse à l’état d’embryons, lorsque le stade de l’œil vient d’être atteint, plutôt qu’à l’état de jeunes larves (c.-à-d. écloses depuis 24 h). Comme les embryons de tête-de-boule éclosent normalement dans un délai de 4 ou 5 jours à une température de 22 à 25 °C, leur transport au stade d’oeuf embryonné dans un délai d’au plus deux jours après le dépôt des oeufs sur des tuiles est l’approche préférée. À la condition que le temps d’expédition ne dépasse pas deux jours (une journée idéalement), cette approche devrait laisser assez de temps pour l’acclimatation des embryons à l’eau témoin/de dilution du laboratoire à la température de l’essai (soit 25 ± 1 EC; sous-section 4.3), avant leur éclosion. Elle permettrait d’éviter que les jeunes larves souffrent d’un stress dû au transport avant le début de l’essai. En outre, elle permettrait au laboratoire d’essai d’établir avec confiance l’âge des larves au début de l’essai (qui doivent être écloses depuis au plus 24 h). Chaque envoi d’organismes d’essai acquis doit être accompagné d’une déclaration écrite précisant l’âge des embryons ou des larves expédiés, ainsi que la date et l’heure d’expédition.

Lorsque des organismes d’essai sont acquis par un laboratoire, le taux de mortalité des poissons au stade larvaire ne doit pas dépasser 10 % (EC, 1999). Dans les cas où des oeufs embryonnés ont été livrés au laboratoire d’essai, la vérification du non-dépassement de ce taux de mortalité exige le dénombrement des larves écloses issues du lot expédié d’oeufs embryonnés ainsi que le dénombrement des larves survivantes de ce lot immédiatement avant leur transfert dans les récipients d’essai. Lorsqu’un laboratoire acquiert de jeunes larves (dont l’éclosion remonte à moins de 24 h), il doit déterminer le nombre de larves vivantes immédiatement avant leur transfert dans les récipients d’essai et le comparer au nombre total de larves (mortes et vivantes) reçues du fournisseur.

La section 6.0 « Acclimation and Holding » dans EC (1999) fournit des informations utiles pour l’acclimatation des organismes d’essai aux conditions du laboratoire avant le début d’un essai. On y présente notamment des modes opératoires pour leur adaptation graduelle à l’eau témoin/de dilution et à la température de l’essai. Ces informations devraient être examinées et suivies dans les cas où l’acquisition d’organismes d’essai est nécessaire.

Dans tous les cas où des organismes d’essai (comme des oeufs embryonnés ou des larves âgées de moins de 24 h) sont acquis par le laboratoire d’essai, la température et la teneur en oxygène dissous de l’eau dans les contenants d’expédition doivent être mesurées et consignées au moment du départ de l’installation du fournisseur ainsi qu’au moment de l’arrivée au laboratoire d’essai (EC, 1999). Pendant le transport, la température de cette eau doit être maintenue à l’intérieur ou proche de la gamme des conditions d’essai prescrites et elle ne doit pas varier de plus de 3EC au cours d’une période de 24 h. En outre, sa teneur en oxygène dissous ne doit pas être inférieure à 80 % du niveau de saturation (EC, 1999). L’eau utilisée pour le transport des organismes d’essai doit être bien oxygénée (p. ex., taux de saturation de 90 à 100 %) avant l’expédition. Une documentation indiquant la température et la teneur en oxygène dissous de l’eau dans laquelle les organismes d’essai sont transportés ainsi que le nombre d’organismes contenus dans l’envoi, leur âge et leur stade de développement doit accompagner l’envoi.

2.3 Élevage

2.3.1 Généralités

Les conditions recommandées et prescrites pour la détention et l’élevage de la tête-de-boule, résumées au tableau 1, sont conçues pour permettre une certaine souplesse au sein d’un laboratoire tout en normalisant les éléments qui, s’ils n’étaient pas contrôlés, pourraient altérer la santé des poissons ou la viabilité de leur progéniture. La majeure partie de la sous-section 2.3 qui concerne particulièrement la tête-de-boule est extraite des rapports de Denny (1987) et de Norberg-King et Denny (1989), que l’on devrait consulter pour obtenir des explications plus détaillées.

Une vidéo de formation préparée par l’EPA des États-Unis (1988) montre les méthodes utilisées à l’Environmental Research Laboratory de Duluth (MN) pour l’élevage de la tête-de-boule. On peut obtenir cette vidéo, disponible au Canada grâce à l’aimable autorisation de T. Norberg-King (EPA, Duluth), pour visualisation, en s’adressant à un bureau régional d’Environnement Canada (cf. annexe B).

De petits groupes de tête-de-boule mâles et femelles sont détenus dans des aquariums pourvus de substrats de frai. Les substrats sont inspectés quotidiennement; ceux sur lesquels se trouvent des embryons sont transférés dans des réservoirs d’éclosion et on installe de nouveaux substrats. Les prélèvements opérés dans les réservoirs d’éclosion permettent d’obtenir des larves écloses depuis 24 h ou moins qui seront utilisées dans les essais. Certains poissons sont élevés pour servir à produire les nouvelles générations de poissons adultes. Deux douzaines de couples d’adultes reproducteurs devraient fournir en moyenne au moins 200 embryons par jour, de façon continue, si les poissons improductifs sont périodiquement remplacés par des poissons atteignant l’âge adulte, et 500 embryons ou plus par jour dans de bonnes conditions.

Toutes les larves utilisées dans un essai doivent provenir du même lot, et leur âge doit être connu. Elles devraient être issues d’au moins trois frais (c.-à-d. de différentes lignées), mais il ne s’agit pas là d’une exigence absolue (EPA, 1989, 1994 et 2002). On recommande fortement que l’élevage de têtes-de-boule utilisé pour l’obtention de lots d’organismes pour des essais de toxicité soit maintenu dans le laboratoire d’essai. Au besoin, cependant, le laboratoire d’essai peut acquérir des organismes d’essai (à l’état d’embryons ou de larves écloses depuis moins de 24 h) à la condition de respecter les conditions et procédures prescrites par Environnement Canada pour l’acquisition d’organismes aux fins d’essais de toxicité (cf. EC, 1999, tableau 1), sauf indications contraires données dans le présent document. Chaque envoi ou chaque groupe acquis représenterait alors un lot distinct d’organismes d’essai.

2.3.2 Installations

L’éclosion et l’élevage des embryons et des larves peuvent se faire dans des réservoirs fabriqués de matériaux non toxiques comme le verre, l’acier inoxydable, la porcelaine, le polyester armé de fibre de verre, les plastiques à base d’hydrocarbures perfluorés (TeflonMC), l’acrylique, le polyéthylène ou le polypropylène.

Tableau 1 Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et prescrits pour l’élevage de la tête-de-boule
Sources de poissons Stock exempt de maladies provenant d’un autre laboratoire. Poissons capturés à l’état sauvage si l’on veille à identifier l’espèce et à éliminer les maladies.
Eau Eau souterraine ou de surface non contaminée ou, si nécessaire, eau municipale déchlorée. Débit dans les aquariums d’élevage : ≥1,4 L par gramme de poisson par jour.
Température Température de détention variant de 4 à 26 °C. Élevage à 25 °C (de 22 à 26 °C), cette température étant obtenue à raison d’au plus 3 °C/d et maintenue entre 22 et 26 °C pendant au moins deux semaines.
Oxygénation/aération Oxygène dissous de 80 à 100 % de saturation, maintenu au besoin par aération avec de l’air filtré et exempt d’huile.
 pH Entre 6,8 et 8,5, de préférence entre 7,0 et 8,5.
Qualité de l’eau La température, l’oxygène dissous, le pH et le débit doivent être surveillés dans chaque réservoir de détention ou d’élevage, de préférence chaque jour.
Éclairage Éclairage à large spectre (fluorescent ou équivalent), de 100 à 500 lux à la surface de l’eau; 16 ± 1 h de lumière et 8 ± 1 h d’obscurité, avec transition progressive de préférence entre la lumière et l’obscurité.
Alimentation   Au moins une fois par jour, avec des artémias congelées et un supplément d’aliments commerciaux en boulettes ou en flocons. Le débit d’alimentation est jugé par la quantité consommée en dix minutes. Les conditions de stockage de la nourriture doivent être conformes aux recommandations du fabricant.
Nettoyage Siphonnage des débris tous les jours ou au besoin.
Mortalité et maladies Mortalité surveillée au moins 5 jours/semaine (de préférence chaque jour) et enlèvement des poissons morts ou moribonds; la mortalité doit être inférieure à 5 % durant les sept jours précédant le prélèvement des oeufs. Éliminer le stock de poissons reproducteurs si le nombre total de sujets morts et malades dépasse 10 % par semaine à n’importe quel moment. Si les poissons sont traités pour prévenir ou combattre des maladies, attendre au moins deux semaines avant de prélever les oeufs pour les essais de toxicité.

L’élevage des têtes-de-boule jeunes et adultes peut se faire dans des aquariums, des bassins ou des réservoirs à écoulement d’eau, lesquels doivent également être fabriqués de matériaux non toxiques tels que ceux mentionnés ci-dessus. On utilise en général des aquariums d’une contenance d’au moins 40 L équipés d’un drain à tube vertical. Les poissons devraient être élevés à l’abri de toute perturbation physique et, de préférence, dans un endroit distinct de celui où se trouvent les récipients d’essai. Les aquariums pour l’élevage sont en général situés à l’intérieur mais peuvent également être à l’extérieur; les aquariums destinés à l’obtention des embryons et des jeunes devraient se trouver dans le laboratoire, exposés aux conditions d’essai normalisées concernant notamment l’éclairage, la température et l’eau.

Les aquariums de reproduction sont divisés ou partiellement divisés, pour les fins du frai, par des écrans en acier inoxydable ou des feuilles de plastique rigide, opaque ou transparent. Un substrat de frai, destiné à servir de territoire à un poisson mâle, est placé dans chacun des compartiments ainsi créés. La configuration exacte peut varier et n’est pas d’une importance cruciale. Un aquarium de 40 L pourrait posséder deux compartiments comportant chacun un substrat de frai avec une cloison percée d’une « porte » permettant les allées et venues des poissons (surtout des femelles). On pourrait également diviser l’aquarium en quatre compartiments destinés à recevoir quatre substrats, avec un mâle et une femelle dans chaque compartiment (Denny, 1987).

Le substrat de frai est constitué par la moitié d’un cylindre de tuile ou de tuyau. Le matériau n’est pas critique et peut être du plastique PCV ou un matériau poreux comme l’argile ou le béton (Benoit et Carlson, 1977). La tuile, d’un diamètre d’environ 10 cm, est coupée en sections de 7 à 10 cm, puis est coupée en deux dans le sens de la longueur. Une moitié inversée est placée dans chaque compartiment destiné à un mâle.

Des bassins en plastique blanc constituent des « plateaux d’éclosion » pratiques si l’éclosion des embryons se fait sur les tuiles. On peut en placer jusqu’à six en immersion partielle dans un grand bain-marie. Si celui-ci est situé sous les aquariums de reproduction, on peut y amener l’eau usée de ces aquariums pour en assurer le chauffage. On peut aussi retirer les oeufs des tuiles et les faire éclore dans une ampoule à décantation (cf. 2.3.8).

2.3.3 Éclairage

Selon la nature et les exigences de l’essai de toxicité, l’éclairage durant l’élevage et la reproduction devrait être naturel ou assuré par des lampes fluorescentes suspendues à spectre continuNote de bas de page 3. Si la photopériode doit être contrôlée, elle devrait normalement correspondre à une séquence constante de 16 ± 1 h de lumière et 8 ± 1 h d’obscurité. L’intensité de l’éclairage devrait être de 100 à 500 lux à la surface de l’eau. Une période de transition de 15 à 30 minutes est recommandée en cas d’éclairage artificielNote de bas de page 4.

2.3.4 Eau

Pour la détention et l’élevage des poissons, on peut utiliser de l’eau souterraine ou de surface non contaminée ou, si nécessaire, de l’eau potable municipale déchlorée (cf. paragraphe suivant). On devrait au préalable avoir démontré que cette eau favorise de façon constante et fiable la survie, la santé et la croissance de la tête-de-boule. Pour assurer la qualité de l’eau, il faudrait effectuer, aussi souvent que nécessaire, des contrôles et des évaluations de variables telles que le chlore résiduel total (si l’on utilise de l’eau municipale), le pH, la dureté, l’alcalinité, le carbone organique total, la conductivité, les solides en suspension, l’oxygène dissous, les gaz totaux dissous, la température, l’azote ammoniacal, les nitrites, les métaux et les pesticides.

L’eau déchlorée n’est pas recommandée pour l’élevage des poissons, en particulier pour l’éclosion des embryons et pour l’élevage des larves. Il est difficile d’éliminer les dernières traces de chlore résiduel et de substances organochlorées, qui pourraient être toxiques pour les larves de tête-de-boule. S’il faut utiliser de l’eau potable municipale pour l’élevage des poissons et comme eau témoin/de dilution, on doit la soumettre à une déchloration efficace pour en extraire toute concentration nocive de chlore. On peut procéder à une aération vigoureuse de l’eau pour éliminer une partie du chlore gazeux volatil. On pourrait ensuite utiliser des filtres au charbon actif (noir d’os) puis un rayonnement ultraviolet (Armstrong et Scott, 1974) pour enlever la plus grande partie de la chloramine résiduelle et des autres composés organochlorés. Il pourrait aussi être avantageux de laisser reposer l’eau dans des bassins de détention aérés. La teneur maximale en chlore résiduel total recommandée pour la protection des organismes d’eau douce est de 0,002 mg/L (CCMRE, 1987); toute valeur supérieure risque d’engendrer une interaction entre la toxicité du chlore et celle de la substance à expérimenterNote de bas de page 5. Outre les mesures de la teneur en chlore, la surveillance de la production d’oeufs et de la survie des poissons peut fournir la preuve de la qualité satisfaisante de l’eau.

Si l’on utilise de l’eau de surface pour l’élevage des poissons, on devrait la filtrer afin d’éliminer les prédateurs ou les compétiteurs potentiels de la tête-de-boule. Un filtre à sable ordinaire ou un filtre sur canalisation commercial conviendrait à cet effet. Les petites quantités peuvent être filtrées sur un filet à mailles serrées (moins de 60 µm). La stérilisation aux ultraviolets est recommandée pour réduire le risque d’introduction d’agents pathogènes dans la colonie de poissons.

S’il faut utiliser de l’eau reconstituée comme eau témoin/de dilution (cf. 5.3), les poissons adultes doivent être acclimatés à cette eau ou à une eau semblable pendant au moins cinq jours immédiatement avant l’obtention des embryons destinés à l’essaiNote de bas de page 6. L’eau semblable pourrait être : a) une eau naturelle dont la dureté correspond à 20 % près à celle de l’eau reconstituée; b) une eau naturelle plus dure, ajustée au moyen d’eau désionisée pour obtenir la dureté souhaitée; ou c) une eau naturelle plus douce ajustée avec une quantité et une proportion appropriées de sels de qualité « réactif » (p. ex., ASTM, 1980; Environnement Canada, 1990b, tableau 2).

L’eau dans les aquariums contenant les poissons adultes devrait être renouvelée dans le but d’empêcher l’accumulation des déchets métaboliques. On devrait admettre au moins 1 mL/min d’eau fraîche dans l’aquarium par gramme de poissons détenus (soit 1,4 L/g par jour ou 6,9 g · d/L)Note de bas de page 7. Pour un aquarium contenant 50 g de poisson, cela correspondrait à un apport de 70 L/d ou de 50 mL/min. Des circonstances exceptionnelles, par exemple, l’acclimatation des poissons à de l’eau reconstituée, peuvent nécessiter le filtrage et la recirculation de l’eau, ou encore son renouvellement périodique dans les systèmes statiques. Un système d’élevage à recirculation est décrit par Rottmann et Campton (1989). En cas de réutilisation de l’eau, il faudrait doser fréquemment l’ammoniac et les nitrites afin de s’assurer qu’ils n’atteignent pas des niveaux nocifs. Les objectifs établis pour la protection de la vie en eau douce sont des concentrations maximales de 0,02 mg/L pour l’ammoniac non ionisé (Ontario, 1984) et de 0,06 mg/L pour les nitrites (CCMRE, 1987).

L’eau qui entre dans les aquariums ne devrait pas être sursaturée en gaz. S’il y a lieu de croire qu’il peut y avoir sursaturation, on devrait vérifier fréquemment la pression de gaz totale de l’alimentation en eau (Bouck, 1982). Si la sursaturation en gaz dissous dépasse 100 %, il faut recourir à des mesures correctives (p. ex., l’utilisation de colonnes d’aération ou une aération vigoureuse dans un réservoir ouvert). L’élimination complète de la sursaturation n’est pas chose facile; si l’on sait ou si l’on soupçonne que ce problème existe, il faudrait effectuer fréquemment des vérifications.

La température de l’eau, l’oxygène dissous, le pH et le débit devraient être surveillés dans chaque aquarium ou récipient, de préférence chaque jour. Il est recommandé de vérifier une fois par semaine, ou plus fréquemment, les teneurs en ammoniac, en nitrites et en chlore résiduel total (si l’on utilise de l’eau municipale).

2.3.5 Température

On peut détenir des lots de poissons en vue d’essais ultérieurs à des températures aussi basses que 4 °C. On devrait éviter les températures élevées : la valeur optimale pour cette espèce est de 23,5 °C, et 32 °C constitue une limite à partir de laquelle on observe des troubles de la reproduction et l’apparition d’effets sur la croissance (Brungs, 1971b). Lors de la préparation d’un lot de poissons pour la reproduction, on peut modifier la température de l’eau à raison d’au plus 3 °C/d jusqu’à ce que l’on atteigne environ 25 °C. Les poissons devraient être maintenus à une température située entre 22 et 26 °C pendant au moins deux semaines et, de préférence, pendant trois semaines ou plus avant que l’on puisse utiliser leurs embryons pour obtenir les larves destinées aux essais de toxicité. On sait que des températures à l’extérieur de l’intervalle de 22 à 26 °C ont pour effet de diminuer la production d’oeufs (Brungs, 1971b).

2.3.6 Oxygène dissous

L’eau des aquariums de détention et d’élevage devrait avoir une teneur en oxygène dissous correspondant à 80 à 100 % de saturation en air. On devrait la soumettre à une aération modérée au moyen d’air comprimé filtré et exempt d’huile. Ce type d’aération, au moyen de pierres de barbotage commerciales, est d’usage courant et contribue à mélanger l’eau et à maintenir des conditions physico-chimiques uniformes. On doit éviter toute aération vigoureuse, surtout en présence de larves ou de jeunes poissons.

2.3.7 pH

Le pH de l’eau utilisée pour la détention et l’élevage des poissons devrait se situer entre 6,8 et 8,5 et, de préférenceNote de bas de page 8 entre 7,0 et 8.5.

2.3.8 Croissance et reproduction des poissons

Les poissons post-larvaires, jeunes et ayant atteint la maturité sont normalement élevés dans des aquariums. Il faudrait réduire graduellement le nombre de poissons par aquarium au fur et à mesure de leur croissance, en transférant des poissons dans d’autres aquariums. Lorsque les poissons approchent de la taille adulte, on peut prélever des mâles et des femelles pour peupler les aquariums de reproduction. Les sexes ne peuvent être distingués que lorsque les poissons atteignent l’âge de se reproduire, ce qui a lieu d’ordinaire entre 16 et 24 semaines (cf. figure 2). Les femelles conservent l’aspect du méné d’argent mais un ovipositeur apparaît en avant de leur nageoire anale. Les mâles sont de plus grande taille; des zones noires apparaissent sur leurs flancs avec deux barres verticales claires près de l’avant du corps, et il leur pousse un bourrelet avec des tubercules sur la partie arrière de la tête et des tubercules sur le front ou museau. Lorsque les poissons sont parvenus à maturité, il faudrait placer dans les aquariums d’élevage deux ou trois substrats de frai. Certains mâles se les approprieront, restant la plupart du temps à l’abri (c.-à-d. sous la tuile ou tout autre substrat de frai) et tenant les autres poissons à distance, sauf pour frayer.

Lorsque les poissons montrent des signes de maturité, on peut sélectionner des mâles et des femelles dans les réservoirs d’élevage et les utiliser pour peupler les aquariums de reproduction. Avec le temps, d’autres mâles prendront possession de substrats et d’autres femelles se développeront, et on pourra ainsi peupler d’autres aquariums de reproduction. Si un aquarium de reproduction est divisé en deux compartiments, il pourrait être peuplé avec deux mâles et de quatre à six femelles. Par ailleurs, on pourrait placer un mâle et une femelle dans chacun de quatre compartiments créés dans un aquarium; selon Denny (1987), la méthode des couples augmente la production totale d’oeufs et permet de la mesurer facilement et, partant, de remplacer les poissons improductifs. Les poissons devraient être remplacés par d’autres s’ils ne produisent pas d’oeufs pendant une période de trois semaines. On pourrait procéder au remplacement automatique des poissons après une période déterminée de trois ou de six mois.

Les oeufs seront déposés à l’intérieur du substrat de tuile, sur son « plafond ». Il faudrait procéder à une inspection quotidienne au milieu de la matinée, car le frai a souvent lieu tôt le matin. Cette inspection peut se faire en tâtant l’intérieur de la tuile avec un doigt ou, ce qui est moins souhaitable, en retirant la tuile pour l’inspecter. Le nombre d’oeufs pondus devrait être estimé et consigné chaque jour, et les chiffres pour chaque période de sept jours devraient être combinés pour établir une valeur hebdomadaire de la fécondité.

Figure 2 Aspect général de têtes-de-boule mâle et femelle ayant atteint la maturité sexuelle et d’une larve environ quatre jours après l’éclosion
Figure 2 General Appearance of Male and Female Fathead Minnows in Breeding Condition, and of a Larva About Four Days After Hatching

(Dessins originaux de M.A. White, d’après des spécimens)

Description longue de la figure 2

Des mâles n’ayant pas atteint la maturité sexuelle ne posséderaient pas de tubercules sur le museau, de bourrelet rugueux sur le sommet de la tête ni de bandes verticales de couleur. Des femelles n’ayant pas atteint la maturité sexuelle ne posséderaient pas d’ovipositeur en avant de la nageoire anale et n’auraient pas le ventre déformé par les oeufs.

 

S’il y a des embryons, on retire la tuile et on la remplace par une tuile propre. La tuile possédant des embryons est transférée dans un plateau d’éclosion. On peut placer deux tuiles bout à bout en cercle, avec une pierre de barbotage à l’intérieur pour entretenir la circulation de l’eau. Pour contribuer à empêcher la propagation d’infections fongiques, il est souhaitable d’aérer individuellement les tuiles dans des béchers immergés dans un plateau d’éclosion (cf. 2.3.2).

Les embryons en incubation doivent être inspectés quotidiennement. Les embryons morts et ceux infectés par des champignons doivent être retirés et jetés; les embryons morts sont opaques ou possèdent une tache blanche à l’intérieur. Les tuiles où la croissance de champignons est importante devraient être éliminées. Les perturbations devraient être minimales du troisième au cinquième jour, car elles peuvent causer une éclosion prématurée. Les embryons éclosent en quatre ou cinq jours selon la température, qui devrait être maintenue entre 22 et 25 °C. Les larves sont ensuite retirées à l’aide d’une pipette de grand calibre munie d’une poire en caoutchouc et sont utilisées pour les essais. Les tuiles de frai utilisées sont désinfectées (cf. 2.3.10); on les laisse tremper dans de l’eau et on les rince à fond avant de les réutiliser.

Pour élever des poissons jusqu’à l’âge adulte afin de former un nouveau stock de reproducteurs, on place des groupes de 200 à 300 larves dans des aquariums avec 20 cm d’eau. Pour ces groupes de poissons, il faudrait estimer approximativement le taux de succès des éclosions de même qu’estimer la mortalité chez les larves durant les 30 premiers jours de leur vie.

Une autre technique d’élevage consiste à faire doucement rouler les oeufs d’une tuile de frai lisse (en PCV) à l’aide d’un doigt mouillé. On place les oeufs dans l’eau d’élevage dans une ampoule à décantation sous aération afin de les maintenir en suspension dans l’eau. Les oeufs morts ou infectés par des champignons sont retirés et jetés après 24 et 48 h. Après 48 h, les œufs viables sont transférés dans l’eau d’élevage dans de petits récipients ou aquariums sous aération vigoureuse où ils demeurent jusqu’à leur éclosion.

En cas d’élevage prolongé de la tête-de-boule dans un laboratoire, il faudrait prendre des mesures pour éviter la sélection d’une souche homogène. On devrait choisir les larves destinées à la reproduction dans des lignées différentes à intervalles réguliers, au lieu de conserver un grand nombre de larves provenant d’un seul frai ou de quelques-uns seulement. Tous les deux ans, le pool génique devrait être enrichi par des échanges avec un autre laboratoire; toutefois, il serait préférable d’introduire quelques poissons sauvages. Les nouveaux poissons devraient être examinés attentivement par un expert en taxinomie. Il faudrait rejeter tout poisson porteur d’une maladie et traiter tous les autres pour cette maladie (cf. 2.3.10 et 2.3.11; Denny, 1987); on devrait ensuite les isoler en petits groupes jusqu’à leur reproduction, de sorte que ce soit bien leur progéniture qui soit ajoutée au stock du laboratoire. Il est encourageant de constater que, lors d’une étude comparative entre dix laboratoires, la source des poissons ne semblait pas avoir d’influence sur les résultats (API, 1988).

2.3.9 Alimentation

Il est recommandé de nourrir les têtes-de-boule jeunes et adultes avec des artémias congelées et un supplément de nourriture commerciale pour poissons. Des aliments commerciaux en « paillettes » peuvent constituer une partie de l’alimentation, mais seulement à titre de supplément aux artémias. Des aliments commerciaux en boulettes de taille assez petite peuvent également être utilisés, toujours à titre de supplément. Selon la température de l’eau et leur taille, les poissons devraient être nourris une ou plusieurs fois par jour, la ration quotidienne correspondant normalement à 1 à 5 % du poids corporel frais. En pratique, la meilleure manière d’estimer la quantité de nourriture requise est d’évaluer la quantité consommée par les poissons en environ dix minutes, la quantité restant au fond du réservoir, et l’aspect et l’état des poissons. La méthode et la durée maximale de stockage de la nourriture pour poissons devraient être conformes aux recommandations du fabricant.

Les poissons récemment éclos destinés à devenir des couples reproducteurs devraient être nourris de nauplius d’artémia (Artemia salina) dont l’éclosion date de moins de 24 h (annexe C). Les larves de tête-de-boule commencent à se nourrir vers la fin de leur première journée de vie ou peu de temps après; par conséquent, on pourrait commencer à les alimenter lorsqu’elles sont âgées d’environ 12 h. On devrait leur fournir des artémias au moins deux fois par jour, car celles-ci ne vivent que 8 h environ dans l’eau douce. La première ration devrait être distribuée tôt le matin, de sorte que les larves de tête-de-boule puissent consommer des nauplius vivants tout au long de la journée. Les poissons au premier stade larvaire ne peuvent ingérer que de petits nauplius d’artémia récemment éclos dont la taille ne dépasse pas de 0,24 à 0,28 mm. Lorsque les larves grandissent, elles peuvent être graduellement habituées aux artémias congelées et à d’autres aliments à titre de supplément. La quantité de nourriture à fournir (c.-à-d. le volume de liquide contenant une concentration estimée de nauplius qui doit être ajouté à chaque période d’alimentation) dépend dans une certaine mesure de la nature du système d’élevage (annexe C).

Il est souhaitable d’évaluer la présence de substances toxiques dans tous les aliments pour poissons, mais en particulier dans les aliments en paillettes et dans les oeufs d’artémia (cf. annexe C). Les substances toxiques à surveiller sont les métaux et les pesticides sujets à la bioaccumulation. On peut souvent se baser sur l’expérience des autres laboratoires et sur les mesures qu’ils ont effectuées. Il est souhaitable d’indiquer d’où proviennent les oeufs d’artémia de sorte que l’on puisse déceler, avec le temps, toute association entre la source d’oeufs et les taux de succès de l’élevage et des essais.

2.3.10 Nettoyage des réservoirs

Les réservoirs utilisés pour la détention et l’élevage des poissons devraient rester raisonnablement propres. Une fois par jour ou aussi souvent que nécessaire, il faudrait, en dérangeant le moins possible les poissons, siphonner la nourriture excédentaire et les excréments afin d’éviter qu’ils ne s’accumulent. Les champignons ou les algues bleues en quantité excessive devraient être grattés et enlevés, et il faudrait s’efforcer d’éliminer toute condition propice à leur croissance. Toutefois, on devrait tolérer la présence en petite quantité d’autres algues et d’invertébrés sur les parois des aquariums, car ils peuvent servir de source supplémentaire de nourriture et d’activité pour les poissons.

Afin de diminuer la fréquence des maladies, il faudrait désinfecter les réservoirs avant d’y déposer un nouveau lot de poissons. Les désinfectants appropriés comprennent ceux qui renferment des composés chlorés ou iodophores, ou du chlorure de
n-alkyldiméthylbenzylammonium (p. ex., CometMC, OvidineMC, ArgentyneMC ou RoccalMC). Étant donné que les désinfectants sont toxiques pour les poissons, les réservoirs devraient ensuite être rincés à fond avec l’eau servant à l’élevage des poissons.

2.3.11 Morbidité, mortalité, maladie et traitement des poissons

Il faudrait inspecter chaque jour les poissons adultes et préadultes afin de détecter des signes de maladies (Amlacher, 1970; Brown et Gratzck, 1980; Roberts et Shephard, 1986)Note de bas de page 9. Il faut au minimum surveiller et consigner les taux de mortalité et tout signe de maladie cinq jours par semaine (p. ex., du lundi au vendredi). Les sujets morts ou moribonds devraient être enlevés immédiatement. Pendant la période de sept jours précédant le prélèvement des oeufs, la mortalité doit être inférieure à 5 % de la population totale élevée et inférieure à 5 % des poissons présents dans chaque réservoir ou aquarium, ou encore limitée à un poisson dans le cas des aquariums de reproduction contenant un petit nombre de poissons. Si la mortalité en sept jours dans n’importe quel de ces groupes se situe entre 5 et 10 %, la détention des poissons doit être prolongée d’au moins sept jours avant de procéder au prélèvement des œufs, et ce tant et aussi longtemps que la mortalité ne sera pas inférieure à 5 % en sept jours. Si, dans un stock de poissons reproducteurs adultes, l’incidence combinée des poissons morts et visiblement malades dépasse à un moment donné 10 % par semaineNote de bas de page 10, ce stock de poissons ne doit pas servir à produire des poissons destinés à des essais. Le cas échéant, il faudrait rechercher activement la cause de ce taux élevé inacceptable de mortalité et/ou de maladie et entreprendre d’autres élevages à partir de stocks apparemment en bonne santé.

Dans la mesure du possible, il faudrait éviter de traiter les poissons malades avec des produits chimiques administrés à titre préventif ou pour combattre la maladie. Il est fortement recommandé de se départir des stocks de poissons qui présentent des signes de maladie plutôt que de les traiter. Un traitement pourrait être envisageable lorsque les lots sont détenus séparément dans plusieurs aquariums ou réservoirs.

Si l’utilisation de poissons traités avec des produits chimiques ne peut être évitée, il faudrait attendre au moins deux semaines après le traitement avant de prélever les oeufs pour des essais. Tout traitement administré à un lot de poissons reproducteurs, que ce soit à titre préventif ou pour combattre la maladie, doit être consigné dans un dossier où seront indiqués la date de chaque traitement, le produit chimique utilisé et la quantité administrée ainsi que les raisons du traitement.

Section 3 Système d’essai

3.1 Installations et appareillage

L’essai doit être réalisé dans une installation isolée des allées et venues générales du laboratoire. S’il n’existe pas de pièce isolée, la zone d’essai devrait être entourée d’un rideau opaque (p. ex., en plastique noir) afin de réduire le stress infligé aux poissons pendant l’essai. La poussière et les émanations devraient être réduites au minimum dans les installations d’essai et d’élevage.

Il faut prévoir une installation d’essai permettant de maintenir la température de toutes les solutions d’essai à une moyenne de 25 ± 1 °C, les fluctuations extrêmes étant comprises entre 23 et 27 °C. On peut y arriver par différents moyens, notamment un appareil de conditionnement de l’air réglé par thermostat ou un bain-marie à température contrôlée dans lequel les récipients d’essai sont immergés.

Les matériaux de construction et les appareils pouvant entrer en contact avec l’eau témoin/de dilution ou les solutions d’essai ne devraient pas renfermer de substances susceptibles de dénaturer par lixiviation les solutions d’essai ou d’accroître la sorption de la substance ou de la matière à expérimenter (cf. 2.3.2). Le laboratoire doit être doté des appareils voulus pour mesurer les variables fondamentales de la qualité de l’eau (température, conductivité, oxygène dissous et pH), et l’on doit être prêt à effectuer une analyse rapide et exacte d’autres variables comme la dureté, l’alcalinité, l’ammoniac et le chlore résiduel.

3.2 Éclairage

Les conditions d’éclairage devraient être identiques à celles définies en 2.3.3. La photopériode doit coïncider avec celle à laquelle les poissons ont été acclimatés.

3.3 Récipients d’essai

Les récipients d’essai peuvent être des béchers ou des contenants rectangulaires en verre borosilicatéNote de bas de page 11 (comme le PyrexMC), en plastique à base d’hydrocarbures perfluorés (TeflonMC) ou en polystyrène jetable. On peut utiliser des contenants non toxiques fabriqués d’autres matières plastiques comme le polypropylène ou le polyéthylène; cependant, on ne devrait généralement pas les réutiliser pour un deuxième essai, car le plastique peut adsorber des substances toxiques qui pourraient être libérées lors d’un essai subséquent. Pour l’essai de produits chimiques (cf. section 5), des récipients d’essai en verre doivent être utilisés pour limiter la sorption.

Le récipient d’essai doit contenir au moins 250 mL de solution durant l’essai; un volume de 500 mL est recommandé. On peut utiliser des volumes pouvant atteindre 1 L, qui offriraient une protection additionnelle contre l’appauvrissement de la substance toxique ou de l’oxygène dissous. Tous les récipients d’essai devraient contenir au moins 3 cm d’eau. Le récipient ne devrait pas limiter indûment l’aire de surface de la solution d’essai, car la diffusion de l’oxygène à travers la surface pourrait être un facteur important lors de l’essai d’effluents ou d’autres matières d’essai ayant une demande en oxygène. À titre indicatif, le diamètre du récipient devrait être approximativement égale à la profondeur de la solution d’essai. Avec une telle valeur, 500 mL de liquide devraient remplir un contenant d’un diamètre de 8,6 cm à une profondeur de 8,6 cm, ce qui donne une aire de surface d’environ 58 cm2.

On dispose d’une latitude considérable pour la conception et la forme des récipients d’essai. Ils peuvent être spécialement construits pour faciliter le renouvellement des solutions d’essai sans endommager les poissons. Par exemple, on peut utiliser un réservoir de verre à vidange munie d’un grillage pour éliminer la solution d’essai usée par siphonnage, les larves étant maintenues sans danger de l’autre côté du grillage (Norberg et Mount, 1985). (Cette méthode exige toutefois encore qu’on déloge et qu’on siphonne les débris directement dans la section contenant les larves.) On peut aussi immerger dans un grand récipient des contenants en plastique dotés d’un fond grillagé, ou d’autres types de « cages » grillagées, qui peuvent être soulevés facilement pour transférer les poissons dans un autre récipient contenant une solution fraîche. Un filet de NytexMC à mailles de 500 µm s’est révélé intéressant, car les artémias mortes peuvent le traverser mais les larves de poisson y sont retenues. Pour un essai donné, la profondeur de l’eau et le type, la taille et la forme du contenant devraient être identiques pour toutes les solutions d’essai et toutes les répétitions utilisées. Il faudrait recouvrir les récipients d’une plaque de verre durant l’essai afin d’éviter tout risque de contamination par l’air et toute perte d’éléments volatils.

3.4 Eau témoin/de dilution

Selon la substance à expérimenter et l’objet de l’essai (sections 5 à 7), l’eau témoin/de dilution peut être : de l’eau souterraine ou de surface (provenant d’un cours d’eau ou d’un lac) non contaminée; de l’eau reconstituée ayant une dureté et un pH particuliers (p. ex., semblables à ceux du milieu récepteur); un échantillon de milieu récepteur recueilli en amont ou à proximité de la source de contamination, mais à l’abri de son influence; ou de l’eau municipale déchloréeNote de bas de page 12 (cf. 2.3.4). Les conditions de prélèvement, de transport et de stockage des échantillons de milieux récepteurs devraient être conformes aux dispositions de la sous-section 6.1. Si l’on utilise de l’eau de surface, on devrait la filtrer sur un filet à mailles serrées (moins de 60 µm) afin d’éliminer tous les prédateurs et compétiteurs potentiels de la tête-de-boule.

L’eau témoin/de dilution doit être amenée à une température de 25 ± 1 °C avant d’être utilisée. Elle ne devrait pas être sursaturée en gaz (cf. 2.3.4). La teneur en oxygène dissous avant utilisation devrait être de 90 à 100 % de la valeur de saturation en air. Au besoin, l’aérer vigoureusement (à l’aide d’un jet d’air comprimé exempt d’huile passant à travers des pierres de barbotage) immédiatement avant l’utilisation, et s’assurer qu’une teneur de 90 à 100 % d’oxygène dissous a bien été atteinte.

Section 4 Modes opératoires universels

Les modes opératoires exposés dans la présente section s’appliquent à l’ensemble des essais de produits chimiques, d’eaux usées et d’échantillons d’eau de milieu récepteur décrits dans les sections 5, 6 et 7. Tous les aspects du système d’essai défini dans la section 3 doivent leur être intégrés. Le tableau 2 présente une liste de contrôle récapitulative des conditions et modes opératoires recommandés et prescrits qui inclut les modes opératoires universels et ceux qui s’appliquent à des types particuliers de matières ou de substances.

4.1 Préparation des solutions d’essai

Tous les récipients, dispositifs de mesure, appareils d’agitation et seaux pour le transfert des poissons doivent être nettoyés et rincés à fond, conformément aux modes opératoires normalisés. On devrait utiliser de l’eau témoin/de dilution pour le dernier rinçage.

Pour tout essai visant à estimer la CL50 (cf. 4.5.1) ainsi que la CIp pour la croissance (c’est-à-dire fondée sur la biomasse; cf. 4.5.1), il faut préparer au moins sept concentrations d’essai, plus un témoin (eau de dilution à 100 %) [on en recommande davantage : au moins huit plus un témoin]Note de bas de page 13. On pourrait utiliser une suite géométrique de dilutions dans laquelle chaque concentration représente environ la moitié de la concentration qui la précède (p. ex., 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,1, 1,6, etc.). D’autres suites conviennent (p. ex., 100, 75, 56, 42, 32, 24, 18, 13, 10, 7,5; cf. annexe D, colonne 7). Si, dans les deux premières heures de l’essai, on observe un taux élevé de mortalité, on devrait ajouter des dilutions supplémentaires. Il n’est pas recommandé d’utiliser couramment un facteur de dilution aussi faible que 30 % (p. ex., concentrations de 100, 30, 9, etc.) parce que cela réduit la précision des estimations de la toxicité. On pourrait y avoir recours en cas de grande incertitude quant à l’intervalle des concentrations qui risquent d’être toxiques.

Lorsqu’on n’a aucune idée de la toxicité de l’échantillon, il est avantageux de procéder à un essai préalable de détermination de l’ordre de grandeur dans l’unique but de choisir les concentrations à utiliser lors de l’essai définitif. Les conditions et modes opératoires de cet essai peuvent être assouplis. Une exposition de 24 h pour déterminer la mortalité des larves à une large gamme de concentrations étalées sur au moins deux ordres de grandeur (p. ex., 100, 32, 10, 3,2 et 1,0, dans le cas de deux ordres de grandeur; 100, 10, 1, 0,1 et 0,01, dans le cas de quatre) devrait aider à sélectionner les concentrations pour l’essai définitif. La concentration maximale de l’essai définitif devrait ne pas avoir produit une mortalité de plus de 20 à 30 % dans l’essai de détermination de l’ordre de grandeur. Si l’on doit respecter des contraintes de temps rigoureuses pour la mise en route de l’essai définitif, on peut opter pour un essai de détermination de l’ordre de grandeur de plus courte durée, par exemple 8 h, qui serait toujours utile.

Des essais à concentration unique pourraient être utilisés à des fins réglementaires (p. ex., essais à résultat unique du type « réussite ou échec »). Pour ces essais, on utiliserait normalement l’effluent, l’élutriat, le lixiviat ou le milieu récepteur non dilué, ou une concentration arbitraire ou prescrite de produit chimique. On aurait recours à des solutions témoins de la même façon que pour les essais à concentrations multiples. On ne décrira pas ici explicitement les essais à concentration unique : la marche à suivre est évidente et toutes les règles s’appliquent, à ceci près que l’essai porte sur une seule concentration et une seule solution témoin.

Tableau 2a Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et prescrits pour les essais
(Modes opératoires universels)
Type d’essai À renouvellement périodique, durée de sept joursNote de bas de tableau a
Eau témoin/de dilution Eau souterraine, eau de surface ou, si nécessaire, eau municipale déchlorée; milieu récepteur prélevé en amont pour évaluer l’effet toxique à un endroit particulierNote de bas de tableau b; eau reconstituée s’il faut assurer un haut degré de normalisation. De 90 à 100 % de saturation en oxygène dissous au moment de l’utilisation dans un essai.
Poissons Larves de tête-de-boule écloses depuis 24 h ou moins, dont la vessie natatoire est manifestement gonflée; toutes du même lot; au moins 10 larves dans chaque répétition.
Répétitions Au moins trois récipients d’essai (répétitions) pour chaque concentration (on en recommande quatre).
Nombre de concentrations Au moins 7, plus le ou les témoins; on en recommande davantage (c.-à-d. au moins 8) plus le ou les témoins.
Contenant et solution Profondeur minimale de 3 cm et diamètre équivalent; volume d’au moins 250 mL, de préférence de 500 mL.
Température Moyenne journalière de 25 ± 1 °C, avec fluctuations extrêmes comprises entre 23 et 27 °C.
Oxygène/ aération Pas de préaération sauf si la teneur en oxygène dissous d’une solution d’essai est inférieure à 40 % ou supérieure à 100 % de saturation lors de la préparation; dans ce cas, toutes les solutions d’essai doivent être aérées pendant 20 minutes ou moins à un débit minimal avant le début de l’essai ou le renouvellement de la solution. La teneur en oxygène dissous doit être comprise entre 40 et 100 % de saturation pendant toute la durée de l’essai, avec un renouvellement plus fréquent des solutions, si nécessaire, pour maintenir la teneur dans cet intervalle. Au besoin, pour se conformer aux objectifs de l’essai, on peut soumettre tous les contenants à une légère aération.
pH Aucune correction si le pH des solutions d’essai est compris entre 6,5 et 8,5Note de bas de tableau c. Un deuxième essai (à pH corrigé) pourrait s’avérer nécessaire ou pertinent si le pH n’est pas compris dans cet intervalle ou est inférieur à 7,0.
Éclairage En général, l’éclairage devrait être assuré par des lampes fluorescentes à spectre continu, éclairement de 100 à 500 lux à la surface de la solution d’essai; normalement 16 ±1 h de lumière et 8 ±1 h d’obscurité, avec transition progressive de préférence.
Alimentation Deux ou trois fois par jour avec des nauplius d’artémia récemment éclos; appliquer ce programme au début de l’essai, mais ne pas nourrir les poissons durant les 12 dernières heures.
Observations Mortalité, toutes les 24 h; poids sec moyen, après 7,0 jours; pour les témoins seulement, incidence combinée de poissons morts, moribonds, présentant une perte d’équilibre ou affichant des signes manifestes de comportement de nage atypique; facultativement (p. ex., à des fins de recherche), observations journalières, pour chaque répétition et chaque traitement, du nombre de poissons survivants qui sont moribonds, manifestent une perte d’équilibre et/ou présentent un comportement de nage atypique.
Mesures Température, pH et oxygène dissous : au moins au début et à la fin de chaque période d’exposition de 24 h, dans des concentrations représentatives. Conductivité : au moins au commencement des périodes de 24 h. Dureté de l’eau témoin et de la solution d’essai à la plus forte concentration : au début de l’essai.
Résultats (paramètres de toxicité) Mortalité et biomasse (comme mesure de la croissance); si l’essai est à plusieurs concentrations, CL50 après 7 jours et CIp après 7 jours pour la réduction de la biomasse (cf. sous-section 4.5).
Produit toxique de référence Chlorure de sodium, phénol et/ou zinc; essai de 7 jours pour l’estimation de la CL50 et de la CIp (pour diminution de la biomasse); à effectuer moins de 14 jours après le début de l’essai définitif, suivant la même méthode et les mêmes modes opératoires; si les organismes proviennent de l’extérieur, vérifier la tolérance des poissons de ce lot à l’égard du produit toxique de référence, en employant le même mode opératoire que dans l’essai définitif.
Validité de l’essai L’essai doit être déclaré invalide si, chez les témoins, l’incidence combinée (pour toutes les répétitions) et cumulative (dans le temps) des poissons morts, moribonds et présentant une perte d’équilibre ou d’autres signes d’un comportement de nage manifestement atypique est supérieure à 20 % en n’importe quelle période d’observation, y compris à la fin de l’essai; les résultats sont également invalides si le poids sec moyen des poissons témoins survivants n’est pas d’au moins 250 μg à la fin de l’essai.
Tableau 2b Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et prescrits pour les essais
(Produits chimiques)
Solvants À utiliser seulement dans des cas particuliers; concentration maximale : 0,1 mL/L.
Concentration Il est recommandé de mesurer la concentration au début et à la fin des périodes de renouvellement du milieu (24 h) dans les solutions à teneur supérieure, moyenne et inférieure et dans les solutions témoins; si les concentrations diminuent de plus de 20 %, reprendre l’essai en prévoyant un renouvellement plus fréquent ou continu des solutions.
Eau témoin/de dilution Tel qu’indiqué ou selon l’objet de l’essai; eau reconstituée s’il faut assurer un haut degré de normalisation; milieu récepteur lorsqu’on veut étudier les effets toxiques locaux; sinon, eau du laboratoire non contaminée.
Tableau 2c Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et prescrits pour les essais
(Effluents, élutriats et lixiviats)
Échantillons Pour les essais exécutés à l’extérieur, prélever trois échantillons subdivisés à partir d’un échantillonnage unique ou ≥3 échantillons prélevés séparément (ou préparés, s’il s’agit d’élutriat) et les manipuler tel qu’indiqué à la sous-section 6.1. Pour les essais sur place, les échantillons sont prélevés quotidiennement et utilisés dans les 24 h. Des volumes de 8-10 L par jour sont normalement suffisants.
Transport et stockage Dès le prélèvement, la température des échantillons chauds (plus de 7 °C) doit être ramenée entre 1 et 7 °C avec de la glace ordinaire (et non de la glace sèche) ou des sacs réfrigérants; on transporte les échantillons à l’obscurité, à 1 à 7 °C (de préférence à 4 ± 2 °C) en les refroidissant, au besoin, avec de la glace ordinaire ou des sacs réfrigérants; l’échantillon ne doit pas geler pendant le transport ou le stockage; on le conserve à l’obscurité, à 4 ± 2 °C; on devrait commencer à l’utiliser dans un essai moins de 1 jour après le prélèvement de l’échantillon ou l’extraction de l’élutriat et on doit le faire moins de 3 jours après.
Eau témoin/de dilution Tel qu’indiqué ou selon l’objet de l’essai; eau du laboratoire ou milieu récepteur en amont pour les essais de surveillance et de conformité.
Teneur élevée en matières solides On pourrait faire un deuxième essai sur un échantillon filtré afin d’évaluer l’effet de la présence de matières solides.
Tableau 2d Liste de contrôle des conditions et modes opératoires recommandés et prescrits pour les essais
(Milieux récepteurs)
Échantillons Comme pour les effluents, lixiviats et élutriats.
Transport et stockage Comme pour les effluents, lixiviats et élutriats.
Eau témoin/de dilution Tel qu’indiqué ou selon l’objet de l’essai; milieu récepteur en amont pour étudier les effets locaux.

Chaque traitement, y compris le ou les témoins, doit comporter au moins trois répétitions (récipients d’essai) si l’on prévoit d’effectuer des estimations ponctuelles (c.-à-d. CL50 et CIp; cf. sous-section 4.5), et on en recommande quatre par traitementNote de bas de page 14. L’essai doit commencer avec un nombre égal de répétitions pour chaque concentration, y compris les solutions témoins. En cas de perte accidentelle d’une répétition au cours de l’essai, on peut analyser des séries de données inégales, mais la puissance de l’analyse est diminuée.

Si l’eau utilisée comme eau témoin/de dilution provient de l’amont du point de rejet (cf. 5.3, 6.3 et 7.3), il faut préparer une deuxième solution témoin en utilisant une eau (source d’eau) de laboratoire qui, d’après les essais du laboratoire, permet d’obtenir régulièrement des résultats valides dans des essais de sept jours portant sur la survie et la croissance de larves de tête-de-bouleNote de bas de page 15. Exception faite des cas où le laboratoire d’essai obtient les organismes d’essai de l’extérieur plutôt que d’un élevage sur place, l’eau du laboratoire dans laquelle les poissons ont été détenus pour la production d’embryons et dans laquelle les embryons se sont transformés en larves doit être utilisée à cette fin. Dans les cas où le laboratoire d’essai obtient les organismes d’essai de l’extérieur, une autre source d’eau de laboratoire non contaminée ayant déjà été démontrée apte à fournir des résultats valides par ce laboratoire peut être utilisée pour la deuxième solution témoin.

Il ne convient pas d’utiliser de l’eau prélevée en amont du milieu récepteur comme eau témoin/de dilution lorsqu’elle ne permet pas de satisfaire aux critères de validité de l’essai (cf. sous-section 4.3). Dans ce cas, on devrait normalement utiliser l’eau du laboratoire utilisée pour les élevages comme eau témoin/de dilution. L’expérimentateur pourrait décider de tenter d’acclimater au préalable les géniteurs dans l’eau d’amont; dans ce cas, toutes les larves produites seraient maintenues dans cette eau jusqu’à ce qu’elles soient utilisées comme organismes d’essai.

Pour chaque essai définitif, la ou les solutions témoins doivent être préparées en même temps que les concentrations testées, et le nombre de répétitions doit être identique. Une série de solutions témoins doit également être préparée avec toute eau de dilution utilisée pour préparer les concentrations d’essai. Chaque solution d’essai doit être bien mélangée avec une baguette de verre, un agitateur en TéflonMC, ou un autre dispositif fait de matériau non toxique. La température doit être ramenée au besoin à 25 ± 1 °C. Il pourrait être nécessaire d’ajuster le pH de l’échantillon destiné aux essais ou des solutions d’essai (cf. 4.3.2) ou de procéder à une aération préliminaire des solutions d’essai (cf. 4.3.1).

4.2 Mise en route de l’essai

On doit utiliser au moins dix poissons par récipient d’essai, avec un nombre égal dans chacun. Chaque essai doit comprendre au moins trois répétitions par traitement (concentration), y compris le ou les traitements témoins (on en recommande quatre). En outre, dans le cas d’un essai à concentrations multiples visant à déterminer une CIp pour l’inhibition de la croissance (déterminée en tant que biomasse) par des analyses de régression (cf. 4.5.1), il faut inclure dans l’essai au moins sept concentrations, plus le ou les témoins (on recommande davantage de traitements [c’est-à-dire au moins huit concentrations plus le témoin]).

Un essai comportant huit concentrations et un témoin, à raison de trois répétitions par traitement (concentration), requiert au moins 270 poissons. Si possible, les larves devraient représenter au moins trois frais (cf. 2.3.1) et elles doivent toutes provenir du même lot. Chaque concentration, y compris le témoin, doit compter le même nombre de répétitions lors de la mise en route de l’essai (au moins trois; cf. sous-section 4.1).

Les larves doivent avoir au plus 24 h au début de l’essai; en outre, leur vessie natatoire doit être gonflée (cf. fig. 3). On ne devrait pas nourrir le lot de larves destinées à un essai avant leur transfert dans les récipients d’essai (cf. 4.3.3).

Il semble que les résultats pourraient varier en raison des différences d’âge à l’intérieur de la période de 24 h, peut-être parce que les larves très jeunes, à la vessie natatoire non développée, pourraient moins bien tolérer les manipulations. En conséquence, on neutralise cette cause possible de variation en choisissant des larves à la vessie natatoire déjà développée (fig. 3) pour l’essai. Normalement, cela signifierait qu’elles auraient entre environ 7 et 24 h (fig. 3). Par ailleurs, l’inspection fréquente des tuiles et des aquariums connexes de reproduction permettrait de sélectionner des larves de 7 à 24 h.

Comme il est possible que les larves issues d’un frai donné soient particulièrement sensibles ou particulièrement tolérantes, on doit tenter de parvenir à l’« homogénéité des unités expérimentales », c’est-à-dire éviter toute différence entre les récipients qui serait imputable au frai. Pour ce faire, il existe deux solutions, qui sont toutes deux valides et adaptées aux mêmes analyses statistiques des résultats (communication personnelle de J.J. hubert, département de mathématiques et de statistique, Université de Guelph, Guelph, Ont.). Selon la première méthode, on peut regrouper des larves provenant de parents ou de frais différents et ayant été détenues séparément, puis les répartir dans les différents récipients. Selon la seconde méthode, on peut répartir également des larves issues d’un frai donné entre toutes les répétitions de toutes les concentrations d’essai, puis faire de même pour les larves issues d’autres frais jusqu’à l’obtention du nombre total de dix. La seconde méthode requiert plus d’attention et d’efforts sur le plan de l’élevage et des manipulations; elle devrait cependant réduire le « bruit » de la variation entre les différentes répétitions d’une même concentration et éliminer le risque que présente la première méthode d’obtenir une grande proportion de larves faibles ou de larves fortes dans un récipient donné, en supposant qu’existe une telle variation liée au frai. Cette dernière méthode est recommandée par Neville (1989).

Avec l’une ou l’autre de ces méthodes, on doit tenter de parvenir à l’homogénéité en répartissant les poissons dans les récipients de la manière suivante. Il faudrait compter les larves dans une série de petits béchers ou gobelets en plastique, en introduisant une, deux ou trois larves à la fois dans chaque bécher jusqu’à ce que l’on ait atteint le nombre total dans tous les récipients. Les poissons ayant une apparence anormale, quelle qu’elle soit, ne doivent pas être retenus pour l’essai. Les poissons devraient être transférés au moyen d’une pipette de grand calibre munie d’une poire en caoutchouc, et l’on doit éliminer tout poisson endommagé ou ayant pu l’être durant le transfert. Le volume d’eau d’élevage transféré dans les récipients d’essai avec les poissons, au cours de leur passage dans la pipette, doit être minimal.

Figure 3 Vue dorsale de larves de tête-de-boule
Larvae of Fathead Minnows as They Appear if Viewed Dorsally

(dessins originaux de C.M. Neville et M.A. White, d’après des spécimens)

Longue description de la figure 3

En haut à gauche : larve juste après l’éclosion; les yeux sont la caractéristique la plus évidente. Au centre : larve éclose depuis 3 ou 4 h, dont la vessie natatoire n’est pas encore gonflée; elle pourrait nager rapidement sur le fond du contenant. En bas à droite : larve à vessie natatoire gonflée, âgée de 7 à 24 h environ; elle peut nager à n’importe quelle profondeur dans l’eau.

En plus de suivre les méthodes exposées ci-dessus, il faut procéder à une répartition aléatoire rigoureuse de chaque lot de dix larves ou plus (c.-à-d. celles dans les récipients de transfert) dans chaque récipient d’essai. On doit également assigner des positions choisies au hasard dans le bain-marie ou autre installation à température contrôlée au groupe de récipients d’essai reproduisant des conditions particulières (p. ex., une concentration d’essai donnée). Chaque récipient d’essai doit porter un code ou une étiquette explicite mentionnant la matière ou la substance à expérimenter, la concentration d’essai ainsi que la date et l’heure à laquelle l’essai a débuté. La température, la teneur en oxygène dissous et le pH de l’eau des récipients devraient être vérifiés et, si cela est nécessaire ou permis, ramenés à des niveaux admissibles avant l’introduction des poissons (cf. 4.3, y compris 4.3.1 et 4.3.2). À titre de vérification des concentrations d’essai, il est recommandé de mesurer la conductivité de chaque nouvelle préparation d’une solution d’essai avant de la répartir dans les récipients d’essai.

4.3 Conditions et critères de validité de l’essai

Il s’agit d’un essai d’une durée de 7 jours avec renouvellement des solutions à des intervalles de 24 hNote de bas de page 16. Les poissons sont nourris d’artémias.

La température de l’échantillon/des solutions doit être ajustée au besoin à la valeur acceptable pour chaque solution (25 ± 1 °C). Ne pas utiliser de thermoplongeurs pour réchauffer les échantillons ou les solutions d’essai vu que cela pourrait en altérer les composantes chimiques et la toxicité. Journellement pendant l’essai, la température moyenne déterminée pour toutes les solutions d’essai, fraîches ou non, doit être de 25 ± 1 °C, les fluctuations extrêmes devant être comprises entre 23 et 27 °C. La température doit être mesurée dans des récipients d’essai représentatifs (c.-à-d. dans au moins les concentrations d’essai supérieure, moyenne et inférieure ainsi que dans les solutions témoins s’il s’agit d’un essai à concentrations multiples). La température doit être mesurée au début et à la fin de chaque période d’exposition de 24 h, dans la solution d’essai fraîchement préparée et dans la solution qui doit être renouvelée, juste avant ou juste après le renouvellementNote de bas de page 17.

L’essai doit être déclaré invalide, et ses résultats inacceptables si, dans les solutions témoins (du laboratoire), l’incidence combinée (c’est-à-dire pour toutes les répétitions) et cumulative (dans le temps) des poissons morts, moribonds, présentant une perte d’équilibre et montrant d’autres signes d’un comportement de nage manifestement atypique est supérieure à 20 %Note de bas de page 18. Si cela se produit n’importe quand pendant l’essai, il faut mettre fin à l’essai. L’essai n’est également pas valide, et ses résultats sont inacceptables, si le poids sec moyen d’une larve témoin survivante est inférieur à 250 µg à la fin de l’essaiNote de bas de page 19.

4.3.1 Oxygène dissous et aération

On ne devrait préaérer les solutions d’essai que si la teneur en oxygène dissous mesurée dans une ou dans plusieurs solutions d’essai fraîchement préparées est inférieure à 40 % ou supérieure à 100 % de saturation en air. Si tel est le cas, chaque solution d’essai devrait être préaérée avant d’y introduire les larves. L’aération devrait se faire par introduction d’air comprimé exempt d’huile au moyen d’une conduite d’air et d’un tube en plastique ou en verre jetable à petite ouverture (p. ex., tube capillaire ou pipette à pointe Eppendorf, avec ouverture de 0,5 mm environ). L’aération devrait se faire au rythme maximum de 100 bulles par minute. La préaération doit être limitée au moindre de 20 minutes ou au temps voulu pour obtenir 40 % de saturation en air dans la solution d’essai de la concentration la plus élevée (ou 100 % de saturation s’il y avait sursaturation)Note de bas de page 20.  Que l’on ait ou non obtenu 40 à 100 % de saturation en air dans toutes les solutions d’essai, l’aération doit être interrompue au bout de 20 minutes. Les solutions d’essai sont alors réparties dans les récipients d’essai et l’essai est mis en route ou les solutions sont utilisées pour le renouvellement. Toute préaération doit figurer dans le procès-verbal de l’essai, y compris la durée et le taux d’aération (cf. section 8).

La teneur en oxygène dissous doit être consignée au début de chaque période de 24 h dans des concentrations représentatives des solutions d’essai fraîchement préparées, dont la concentration la plus élevée; les exigences mentionnées au paragraphe précédent s’appliquent également dans ce cas. On doit également effectuer des mesures dans des concentrations représentatives à la fin des périodes de 24 h, afin d’établir l’ampleur de l’appauvrissement de l’oxygène avant le renouvellement des solutionsNote de bas de page 21 (cf. sous-section 4.4).

La teneur en oxygène dans les récipients d’essai ne devrait pas descendre au-dessous de 40 % de saturation (3,3 mg/L à 25 °C). Si cela se produit, l’expérimentateur devrait être conscient que l’essai ne mesure pas la toxicité intrinsèque de la matière ou de la substance testée. Dans de telles conditions, c’est plutôt l’effet total de la matière (p. ex., un effluent) ou de la substance (p. ex. un produit chimique) qui est mesuré, y compris son influence sur la désoxygénationNote de bas de page 22. Les mesures initiales permettent de prédire des problèmes potentiels liés à l’oxygène dissous, auquel cas il est nécessaire de procéder à des vérifications régulières de la teneur en oxygène. L’utilisation obligatoire d’eau de dilution/témoin saturée en oxygène et le renouvellement quotidien des solutions d’essai maintiendront, dans la plupart des cas, la teneur en oxygène à des niveaux supérieurs à ceux qui sont gravement dommageables pour les larves et qui exercent une influence considérable sur les résultats. Si la demande en oxygène de la matière ou de la substance soumise à l’essai est élevée, il pourrait être nécessaire de renouveler plus fréquemment les solutions d’essai afin de maintenir la teneur en oxygène dissous à au moins 40 % de saturation. Si un renouvellement plus fréquent des solutions d’essai n’améliore pas la situation et que les objectifs de l’essai exigent une teneur en oxygène dissous d’au moins 40 % de saturation pour la mesure de la toxicité intrinsèque, il faudrait alors aérer chaque récipient d’essai. L’aération devrait se faire avec une pipette en verre ou en plastique jetable avec pointe à alésage étroit (p. ex., 0,5 mm de diamètre intérieur) à raison d’au plus 100 bulles par minute. Toute aération des solutions avant l’essai [« préaération » (cf. 4.1)] ou en cours d’essai doit se faire à un taux minimal et contrôlé. Toute aération en cours d’essai doit être signalée dans le procès-verbal de l’essai, en indiquant le taux d’aération (cf. section 8).

Il se peut aussi que les objectifs de l’essai exigent l’inclusion de la demande en oxygène dans l’effet total de l’échantillon, auquel cas on devrait conserver la fréquence quotidienne du renouvellement et ne pas avoir recours à l’aération.

4.3.2 pH

Le pH devrait être mesuré dans la solution témoin ainsi que dans les concentrations supérieure, moyenne et inférieure au début de l’essai, avant l’introduction des poissons. Le pH doit également être mesuré dans des récipients représentatifs au début et à la fin de chaque période de 24 h, c’est-à-dire dans la solution d’essai fraîche et dans la solution usée, juste avant ou juste après le renouvellement (cf. note 17 et sous-section 4.4, paragraphe sur les mesures photochimiques).

Les essais de toxicité devraient normalement être effectués sans ajustement du pH. Dans les cas où un échantillon d’une matière ou substance testée crée dans une solution d’essai un pH qui se situe à l’extérieur de l’intervalle de 6,5 à 8,5, si l’objectif est d’évaluer un ou des produits chimiques toxiques plutôt que les effets nocifs ou modificateurs du pH, il convient d’ajuster le pH de la solution d’essai ou de l’échantillon avant d’y déposer les poissons, ou d’effectuer parallèlement un deuxième essai (avec ajustement du pH) en utilisant une partie du même échantillonNote de bas de page 23. Pour ce deuxième essai, avant l’exposition des poissons, le pH initial de l’échantillon ou de chaque solution d’essaiNote de bas de page 24 pourrait, selon les objectifs de l’essai, être neutralisé (ramené à la valeur de 7,0) ou ramené à une valeur correspondant, à 0,5 unité près, au pH de l’eau témoin/de dilution. Selon une autre démarche admissible pour ce deuxième essai, on peut ramener le pH de chaque solution d’essai (y compris les solutions témoins) à une valeur de 6,5 à 7,0 (si échantillon d’essai a ou produit un pH inférieur à 6,5) ou de 8,0 à 8,5 (si l’échantillon d’essai a ou produit un pH supérieur à 8,5). Des solutions d’acide chlorhydrique (HCl) ou d’hydroxyde de sodium (NaOH) de titre inférieur ou égal à 1 N devraient normalement être utilisées pour toutes les opérations d’ajustement du pH. Certaines situations (p. ex., des échantillons d’effluents à pouvoir tampon élevé) pourraient nécessiter l’utilisation de teneurs supérieures d’acide ou de base.

Dans certains cas, on pourrait souhaiter d’effectuer l’essai le plus sensible possible pour la détection des produits chimiques toxiques, au lieu d’inclure le pH dans l’effet total d’un produit chimique, d’un effluent, d’un élutriat ou d’un lixiviat. Il faudrait alors éliminer les effets négatifs du faible pH sur la croissance et la survie des larves en augmentant le pH des solutions d’essai, au besoin, à une valeur d’au moins 6,8 ou, de préférence, d’au moins 7,0 (cf. 2.3.7, note 8).

Abernethy et Westlake (1989) fournissent des lignes directrices utiles pour l’ajustement du pH. Il faudrait laisser s’équilibrer, après chaque addition d’acide ou de base, les aliquotes de solutions d’essai ou d’échantillons faisant l’objet d’un ajustement du pH Note de bas de page 24. Le délai nécessaire pour atteindre l’équilibre dépend du pouvoir tampon de la solution ou de l’échantillon. Pour les échantillons d’effluents, il est recommandé de prévoir une durée de 30 à 60 minutes pour l’ajustement du pH (Abernethy et Westlake, 1989). Une fois l’essai mis en route, le pH de chacune des solutions d’essai est mesuré régulièrement (cf. 4.4), mais il n’est pas ajusté.

Lorsque l’essai de toxicité vise à permettre de mieux comprendre la nature des substances toxiques présentes dans un échantillon d’effluent, d’élutriat, de lixiviat ou de milieu récepteur, on utilise souvent l’ajustement du pH, en conjonction avec un certain nombre d’autres techniques de traitement (p. ex., l’oxydation, le filtrage, l’extraction à l’air et l’addition d’agents chélateurs), pour caractériser la toxicité de l’échantillon. Mount et Anderson-Carnahan (1988) comptent l’ajustement du pH parmi neuf techniques d’évaluation d’identification de la toxicité qui, lorsqu’on les applique à des échantillons aqueux de toxicité aiguë, constituent une méthode utile pour déterminer la nature physique ou chimique des substances toxiques et leur sensibilité à la détoxication.

4.3.3 Alimentation

Avant leur transfert dans les récipients d’essai et le début de l’essai, les larves ne devraient pas être nourries. Elles le sont immédiatement après le début de l’essai, avec des nauplius d’artémia vivants (cf. 2.3.9 et annexe C). L’objectif est que les poissons puissent disposer constamment d’artémias vivantes durant les heures du jour, mais il ne faut pas que ces crustacés soient présents en excès dans les récipients d’essai parce qu’ils prélèvent une partie de la substance toxique et qu’ils meurent après un certain temps dans l’eau douce (et dans les solutions d’essai), ce qui pourrait réduire la concentration d’oxygène dissous dans les récipients d’essai.

Les groupes de dix poissons devraient être nourris avec au moins 1500 nauplius par jour et, de préférence, avec 2 250 nauplius par jour. Cette quantité devrait être répartie en deux rations quotidiennes, la première étant distribuée tôt le matin. Les rations supérieures n’améliorent pas la croissance (cf. annexe C; Silberhorn, 1989). Si un récipient contient plus de larves (en raison du transfert accidentel de plus de dix larves dans le récipient) ou s’il en contient moins (par suite de décès ou de pertes accidentelles), il faudrait ajuster en conséquence (c.-à-d. proportionnellement) le nombre de nauplius donnés.

On ne nourrit pas les poissons durant les 12 dernières heures de l’essai, afin d’éviter de peser les aliments se trouvant dans leur tube digestif.

4.3.4 Renouvellement des solutions d’essai

Il s’agit d’un essai à renouvellement périodique dans lequel les solutions doivent être renouvelées presque complètement (au moins à 80 %) à des intervalles de 24 h après le début de l’essai. On procède normalement par siphonnage ou à l’aide d’une pipette. Il est souhaitable de remplacer les solutions selon un ordre aléatoire parmi les divers contenants d’une concentration donnée, en particulier s’il est difficile de maintenir l’homogénéité de la matière ou de la substance à expérimenter en raison de la décantation de certains de ses éléments.

Durant le renouvellement, il faudrait commencer par retirer les artémias mortes et les autres détritus se trouvant au fond de chaque récipient, puis aspirer la solution restante jusqu’à une hauteur de 7 à 10 mm (suffisante pour permettre aux poissons de continuer à nager). Selon la forme du récipient, il pourrait être nécessaire de l’incliner pour parvenir à retirer 80 % de la solution en conservant la hauteur minimale. On ajoute lentement la solution d’essai fraîche jusqu’à l’obtention du volume total d’origine de solution d’essai dans chaque récipient. Il convient de procéder avec précaution durant cette opération afin d’éviter d’endommager les poissons; pour rendre les larves plus visibles, on peut travailler sur une table lumineuse. Dans tous les cas, la solution qui est retirée par siphonnage ou par une autre méthode doit être transférée dans un plateau blanc de sorte que l’on puisse vérifier si on n’a pas prélevé de larves par mégarde. Ces larves risquent fort d’être endommagées et devraient être éliminées; il faudrait alors consigner sur les feuilles de travail l’enlèvement accidentel des larves et analyser les résultats de l’essai comme si elles n’avaient pas été présentes.

Le siphonnage est beaucoup plus facile à exécuter sans risque de retirer par mégarde des poissons lorsqu’on emploie des récipients ayant une vidange grillagée. Si l’on utilise des contenants à fond grillagé, une fois les débris siphonnés, on retire rapidement mais doucement ces contenants des récipients de solution d’essai usée et on les place dans des récipients de solution fraîche. Le fait que les larves se retrouvent momentanément hors du liquide ne semble pas les affecter, si l’opération est faite avec délicatesse. On peut avoir recours à d’autres techniques si l’appareillage est fait des matériaux non toxiques mentionnés à la sous-section 3.3, si la solution est renouvelée dans la proportion requise et si les organismes témoins ont une croissance acceptable (cf. les exigences minimales pour la croissance énoncées dans la sous-section 4.3, y compris la note 19). Par exemple, Parrott (1988) a mis au point une technique de « transfert en immersion » des larves d’un contenant à fond grillagé à un nouveau contenant, ce qui permet de placer les poissons dans des contenants propres au début de chaque période de 24 h.

4.4 Observations et mesures

La mortalité dans chaque récipient d’essai doit être déterminée et consignée à des intervalles de 24 h à partir du début de l’exposition jusqu’à la fin de l’essai, après sept jours d’exposition. Les poissons sont considérés morts lorsqu’ils n’ont aucune activité de nage, même lorsqu’ils sont stimulés par un jet peu puissant de solution d’essai produit par une pipette de grand calibre. Tout poisson mort devrait être éliminé. Souvent, l’examen ne permet pas de détecter les larves mortes parce qu’elles se décomposent rapidement et qu’on ne peut les distinguer des débris au fond du récipient.

Dans le cas des traitements témoins seulement, des observations journalières sont requises pour déterminer et consigner, pour chaque répétition, le nombre global et cumulé (dans le temps) des larves mortes, moribondes, présentant une perte d’équilibre et montrant des signes manifestes de comportement de nage atypique.

Facultativement (p. ex., lorsque cette méthode est utilisée à des fins de recherche), l’expérimentateur pourrait vouloir déterminer et consigner journellement, pour chaque répétition de chaque traitement, le nombre global des larves survivantes observées qui étaient moribondes, présentaient une perte d’équilibre et/ou montraient des signes manifestes de comportement de nage atypique. Dans le cas d’un essai à plusieurs concentrations, de telles observations journalières pourraient servir à déterminer une CEp (p. ex., CE20 ou CE50) pour un effet sur l’aptitude à la nage (cf. EC, 2005, section 4, pour des conseils concernant cette détermination statistique).

À la fin de l’exposition de sept jours, les poissons vivants sont comptés, séchés et pesés. Pour chaque récipient de solution d’essai (c.-à-d. chaque répétition d’un traitement, y compris le ou les traitements témoins), on détermine le poids sec du groupe de poissons. On peut transférer chaque larve du récipient d’essai à un récipient de rinçage contenant de l’eau de dilution propre afin d’éviter d’inclure des débris lors de la pesée. Le rinçage devrait être bref. Après le rinçage, on peut regrouper les poissons dans une épuisette et les transférer dans des plateaux de pesée au moyen de pinces fines, en veillant à ne briser aucune de leurs parties. On peut utiliser avantageusement d’autres techniquesNote de bas de page 25.

Les poissons devraient être séchés immédiatement dans de petites nacelles de pesée, tarées et numérotées, soit à 100 °C pendant 6 h, ou à 60 °C pendant 24 hNote de bas de page 26. Les nacelles doivent être transférées dans un dessiccateur dès leur sortie du four. Elles devraient être ensuite retirées du dessiccateur une à une, au hasard, et pesées sur une balance permettant des mesures fiables jusqu’à 10 µg. Comme les poissons absorbent rapidement la vapeur d’eau, les nacelles doivent être pesées rapidement en observant le même temps de pesée pour chacune. Éviter cependant tout mouvement brusque sous risque de faire sortir des larves non fixées de la nacelle. Pour la pesée, il faudrait retirer les plateaux selon un ordre aléatoire, replacer le premier plateau pesé dans le dessiccateur et le peser à nouveau à la fin pour déterminer le gain d’eau dans les derniers plateaux pesés (cf. note 25). Le gain ne devrait pas être supérieur à 5 %; s’il l’était, on pourrait sécher encore les plateaux pendant moins de 2 h et les peser à nouveau. Quelques nacelles de pesée devraient être tarées, séchées et pesées sans poisson, et les résultats devraient être conformes aux normes de contrôle de la qualité du laboratoire.

Les mesures physicochimiques effectuées pendant l’essai doivent inclure la température, la teneur en oxygène dissous et le pH dans des récipients d’essai représentatifs, au début et à la fin de chaque période d’exposition de 24 h (sous-section 4.3). Ces paramètres doivent être mesurés dans la solution d’essai fraîchement préparée et dans la solution devant être renouvelée, juste avant ou juste après le renouvellement (cf. sous-section 4.3, note 17). S’il s’agit d’un essai à concentrations multiples, ces mesures doivent inclure au moins les concentrations d’essai supérieure, moyenne et inférieure ainsi que les solutions témoins. La conductivité des solutions d’essai devrait également être mesurée, tout au moins au début des périodes d’exposition de 24 h. La dureté de l’eau témoin/de dilution et, au minimum, de la concentration d’essai supérieure devrait être mesurée et consignée au début de l’essai.

4.5 Résultats et calculs

Les résultats (paramètres estimés de toxicité) de cet essai de sept jours se fondent sur les effets néfastes des matières ou des substances d’essai pour la survie et la croissance des larves de tête-de-boule. L’essai permet d’estimer deux paramètres de nature biologique : le premier, fondé sur la mortalité accrue des organismes exposés au contaminant; le second, fondé sur la réduction de la biomasse des larves en raison de leur exposition au contaminant.

À la fin de chaque exposition, on consigne le nombre de poissons vivants et le nombre de poissons morts dans chaque contenant de la solution témoin et des différentes concentrations de la matière ou de la substance d’essai. On devrait soustraire du nombre initial de larves dans chaque répétition, au début de l’essai, le nombre de poissons qui, dans cette répétition, ont été accidentellement tués ou retirés des solutions d’essai pendant leur renouvellement journalier (cf. 4.3.4), comme s’ils n’avaient pas fait partie de l’essai.

On calcule le poids sec moyen par poisson pour les sujets ayant survécu dans chaque contenant (c.-à-d. dans chaque répétition de chaque concentration et de la solution témoin). Conformément à l’EPA (2002; cf. 11.10.9 et 11.13.3.1), il faut calculer le poids sec moyen de chaque poisson en tant que mesure de la biomasse. À cette fin, on divise le poids (sec) total des poissons survivants à la fin de l’essai dans chaque récipient par le nombre de larves déposées dans ce récipient au début de l’essai (10, probablement). Dans ce calcul de la biomasse, on devrait soustraire du nombre initial de larves le nombre de poissons qui, dans chaque répétition, ont été accidentellement tués ou accidentellement retirés du milieu pendant le renouvellement journalier des solutions d’essai (cf. 4.3.4), comme s’ils n’avaient pas fait partie de l’essai.

Le paramètre « fondé sur la biomasse » tient à la fois compte de l’effet sublétal (c’est-à-dire du poids sec total réduit de poissons survivants dans chaque répétition à la fin de l’essai) et de la mortalité. Comme il intègre les effets sur la survie aux effets sur la croissance (poids sec des poissons survivants), il est susceptible de se révéler plus sensible aux échantillons toxiques que le paramètre fondé sur la croissance qui découle d’un seul effet sublétal (c’est-à-dire déterminé conformément à la première édition de l’essai d’Environnement Canada d’une durée de 7 jours mesurant la croissance et la survie de larves de tête-de-boule; EC, 1992)Note de bas de page 27.  En 8.2 dans le guide d’Environnement Canada sur les méthodes statistiques recommandées pour les essais d’écotoxicité (EC, 2005), on décrit l’emploi de ce paramètre comme l’une des trois possibilités de mesurer la croissance en tant qu’effet sublétal quantitatif. En tant que paramètre statistique de la toxicité, la biomasse finale reçoit la valeur zéro si tous les poissons d’une répétition sont morts (EC, 2005).

Comme il a été indiqué à la sous-section 4.3, l’essai n’est pas valide si, pour les solutions témoins [du laboratoire], l’incidence combinée (c’est-à-dire pour toutes les répétitions) et cumulative (dans le temps) des poissons morts, moribonds, présentant une perte d’équilibre et montrant d’autres signes d’un comportement de nage manifestement atypique est supérieure à 20 %. L’essai n’est pas valide non plus si, effectivement (après séchage et pesée), le poids sec final moyen combiné (pour toutes les répétitions) des poissons témoins survivants n’atteint pas 250 µg (EPA, 2002). Avec des modes opératoires convenables, il ne devrait pas être difficile d’atteindre des poids secs finals moyens de 350 µg en eau douce et de 500 µg en eau dureNote de bas de page 28.

4.5.1 Essais à plusieurs concentrations

Dans un essai à concentrations multiples, les résultats statistiques exigés (paramètres de toxicité à estimer) sont : (i) la CL50 (et ses limites de confiance à 95 %), pour ce qui concerne la mortalité des larves de tête-de-boule; (ii) la CIpNote de bas de page 29,Note de bas de page 30, et ses limites de confiance à 95 %, fondée sur la biomasse (c’est-à-dire, dans une répétition, le poids sec total des larves survivantes à la fin de l’essai, divisé par le nombre de larves au début de l’essai). On trouve dans Environnement Canada (2005) des conseils pour le calcul de la CL50 et de la CIp, accompagnés d’organigrammes pour aider à choisir les tests statistiques appropriés. Tous les tests statistiques utilisés pour l’estimation de paramètres de toxicité exigent la saisie des concentrations sous forme de logarithmique.

Il est fortement recommandé, pour se faire une représentation visuelle des données et vérifier le caractère convenable des résultats par comparaison avec des calculs statistiques ultérieurs, de commencer par porter sur un graphique les données brutes fondées sur la biomasse en fonction du logarithme des concentrationsNote de bas de page 31  Il faut résoudre tout écart important entre la CIp déterminée de façon approximative par la méthode graphique et la CIp calculée ultérieurement par l’ordinateur. Le graphique montrerait également si l’on a obtenu une relation logique entre la concentration logarithmique (ou, dans certains cas, la concentration) et l’effet, caractéristique souhaitable d’un essai valide (EC, 2005).

Principale technique statistique, la régression doit servir au calcul de la CIp, à la condition de satisfaire aux hypothèses exposées ci-dessous. Un certain nombre de modèles permettent d’évaluer par régression les données sur la reproduction (au moyen d’un test statistique quantitatif). La régression exige que les données satisfassent aux hypothèses de normalité et d’homoscédasticité.

On peut appliquer des techniques de pondération pour satisfaire à l’hypothèse d’homoscédasticité. On recherche aussi parmi les données les valeurs aberrantes, à l’aide de l’une des techniques recommandées (cf. EC, 2005, § 10.2). Il faut tenter d’ajuster plus d’un modèle aux données. Enfin, on doit retenir le modèle le mieux ajustéNote de bas de page 32  comme étant celui qui convient le mieux à l’estimation de la CIp et de ses limites de confiance au seuil de 95 %. Pour déterminer le meilleur ajustement, on recommande que la moyenne des carrés des erreurs résiduelles soit minimale; on la trouve dans la table de l’analyse de variance de n’importe lequel des modèles. Les paramètres de toxicité estimés par régression doivent être encadrés par des concentrations utilisées dans l’essai; il est inacceptable de les estimer par extrapolation.

Si tous les poissons d’une répétition donnée étaient morts pendant l’essai, on attribuerait à leur poids (et à la biomasse) la valeur nulle. Toute larve accidentellement disparue ou blessée pendant l’exposition devrait être soustraite du nombre initial de larves de cette répétition, pour le calcul de sa biomasse (conformément à l’option 3 décrite dans EC, 2005, § 8.2).

Dans le cas de certaines matières ou substances fortement toxiques, on peut se retrouver avec aucune larve survivante dans toutes les répétitions d’une ou de plusieurs concentrations d’exposition. Les résultats pour les concentrations expérimentales supérieures ne donnent aucun renseignement supplémentaire sur la réaction de l’organisme, et les zéros répétitifs gênent les hypothèses de normalité et d’homoscédasticité posées pour les besoins de la régression. En conséquence, il faut supprimer, avant d’effectuer la régression, les données associées à toutes les concentrations supérieures entraînant une survie nulle des larves dans toutes les répétitions.

La capacité de décrire mathématiquement l’hormèse (c’est-à-dire la stimulation des organismes ou une réponse de ces derniers meilleure que celle du témoin et qui ne se produit qu’à de faibles concentrations) dans la courbe dose-réponse a été intégrée dans les modèles récents de régression pour les données quantitatives (cf. EC, 2005, § 10.3). Les données hormétiques peuvent être saisies directement, le modèle pouvant s’adapter à tous les points de données et pouvant les intégrer; il n’y a pas d’élagage des points de données révélant une réponse hormétique.

Si les données ne se prêtent pas à la régression (c’est-à-dire qu’on ne peut pas satisfaire aux hypothèses de normalité et d’homoscédasticité), on peut se servir de l’interpolation linéaire (p. ex., le programme ICPIN; cf. EC, 2005, § 6.4.3) pour estimer une CIp.

Pour chaque concentration d’essai, y compris le ou les traitements témoins, il faut calculer et signaler les statistiques suivantes : (i) la moyenne cumulative [± l’écart type (sx)] du taux de mortalité des larves, à la fin de l’essai; (ii) la moyenne (cumulative) [± sx] de la biomasse des larves vivantes à la fin de l’essai. Dans la sous-section 8.1, on énumère ces calculs à faire et d’autres conditions minimales à satisfaire dans le procès-verbal de l’essai.

4.5.2 Essais à concentration unique

Dans l’essai à concentration unique, on compare à la réponse du témoin la réponse observée à la concentration utiliséeNote de bas de page 33Si on évalue la mortalité (phénomène quantique) en un seul endroit et dans un lieu témoin, le choix des tests statistiques dépend de l’existence ou non de répétitions. Si l’évaluation porte sur plusieurs emplacements, on conseille à l’expérimentateur de consulter un statisticien. Si on évalue la biomasse (paramètre quantitatif) en un seul endroit et un lieu témoin, le test tNote de bas de page 34  est normalement la méthode qui convient pour comparer les données livrées par la concentration d’essai et le témoin. Dans les situations où l’étude s’intéresse à plus d’un lieu et où l’expérimentateur souhaite comparer plusieurs lieux au témoin ou comparer des lieux entre eux, il existe divers tests d’analyse de variance (ou leurs équivalents non paramétriques) [EC, 2005, § 3.3]. Le choix du test dépend des conditions suivantes :

  1. du type de comparaison que l’on veut établir (p. ex., effectuer une série de comparaisons par paires de tous les lieux ou comparer les données de chaque endroit à celles du témoin uniquement);
  2. de l’attente d’un gradient de réponses chimiques et/ou biologiques;
  3. de la satisfaction des hypothèses de normalité et d’homoscédasticité.

Comme dans l’essai à plusieurs concentrations, les autres calculs à faire et à communiquer dans l’essai à concentration unique sont notamment les suivants : (i) la moyenne (cumulative) [± sx] du taux de mortalité des larves de tête-de-boule dans chaque traitement, à la fin de l’essai; (ii) la moyenne (cumulative) [± sx] de la biomasse, dans chaque traitement, à la fin de l’essai. Dans la sous-section 8.1, on expose ces exigences et d’autres exigences minimales pour le procès-verbal de l’essai.

4.6 Produits toxiques de référence

Dans des conditions d’essai normalisées, l’utilisation courante de produits toxiques de référence est nécessaire pour évaluer la sensibilité relative des groupes de poissons soumis à l’essai ainsi que la précision et la justesse des données obtenues en laboratoire pour ces produits (Environnement Canada, 1990c). Il faut déterminer la sensibilité des jeunes larves de tête-de-boule (écloses depuis, au plus, 24 h) au(x) produit(s) toxique(s) de référence en mettant en marche un essai de toxicité de référence avec des poissons de ce stade, dans les 14 jours précédant ou suivant la date du début de l’essai de toxicité, ou en effectuant cet essai en même temps que l’essai définitif. Les larves dont on a besoin pour les essais avec le produit toxique de référence et l’échantillon devraient provenir du même stock de géniteurs. Lorsque l’essai de toxicité de référence coïncide avec l’essai définitif de toxicité, il faut utiliser pour chacun de ces deux essais le même lot d’organismes. Les essais avec les produits toxiques de référence doivent se dérouler dans les mêmes conditions et selon les mêmes méthodes que celles appliquées pour les essais avec le ou les échantillons évalués.

Si le laboratoire se procure les organismes d’essai à l’extérieur plutôt que de les choisir dans un élevage sur place, ce qui est l’approche recommandée (cf. sous-section 2.2), il faut vérifier la tolérance au(x) toxique(s) de référence d’une partie des larves de chaque lot. L’essai de toxicité de référence doit se dérouler dans les mêmes conditions expérimentales que celles de l’essai portant sur le ou les échantillons. Il doit avoir lieu en même temps que l’essai définitif.

Les critères appliqués au choix des produits toxiques de référence convenant à cet essai sont les suivants :

  • Facilité d’obtention à l’état pur;
  • Longue durée de conservation (stabilité);
  • Solubilité élevée dans l’eau;
  • Stabilité en solution aqueuse;
  • Danger minime pour l’utilisateur;
  • Analyse facile et précise;
  • Bonne courbe dose-réponse pour les têtes-de-boule;
  • Influence connue du pH sur sa toxicité pour l’organisme d’essai;
  • Influence connue de la dureté de l’eau sur sa toxicité pour les têtes-de-boule.

Pour cet essai, un ou plusieurs des produits toxiques de référence suivants de qualité « réactif » doivent être utilisés : chlorure de sodium, phénol ou zinc (préparé au moyen de sulfate de zinc). La sensibilité des poissons doit être évaluée au moyen d’essais normalisés selon les méthodes indiquées dans le présent document afin de déterminer la CL50 (pour la survie) ainsi que la CIp (pour la biomasse) d’au moins un de ces produits chimiques. Pour les essais, il faudrait prendre l’eau témoin/de dilution habituellement utilisée au laboratoire, ou encore de l’eau reconstituée s’il faut un haut degré de normalisationNote de bas de page 35.

Les conditions expérimentales et modes opératoires pour les essais avec des produits toxiques de référence doivent être cohérents et conformes aux descriptions faites dans le présent document.

Une fois que l’on dispose de suffisamment de données (EC, 1990c), un diagramme de contrôle sur lequel sont portées la CL50 et/ou la CIp doit être établi et mis à jour pour chaque produit toxique de référence utilisé. On y porte séparément les valeurs successives de la CL50 (pour la survie) et/ou de la CIp (pour la biomasse) et on détermine si les résultats s’inscrivent dans l’intervalle de ± 2 fois l’écart type des valeurs respectives obtenues dans les essais précédents. Pour chaque CL50 et CIp, on recalcule la moyenne géométrique ainsi que ses limites supérieure et inférieure de contrôle respectives (± 2 fois l’écart type, calculé en fonction des données logarithmiques) jusqu’à l’obtention de statistiques stables (EPA, 1989, 1994 et 2002; EC, 1990c).

Le logarithme de la concentration (c.-à-d. le logarithme de la CL50 et/ou de la CIp) doit être utilisé dans tous les calculs de la moyenne ou de l’écart type et dans toutes les méthodes de présentation graphique. On a de la sorte l’assurance que toutes les valeurs finales ont été estimées en fonction des logarithmes de concentrations. Le diagramme de contrôle peut être établi en reportant les logarithmes de la moyenne et des valeurs de ± 2 fois l’écart type sur du papier à échelle arithmétique, ou en portant les valeurs arithmétiques sur l’échelle logarithmique de papier semi-logarithmique. Lorsqu’on ne peut obtenir une distribution log-normale des CL50 ou des CIp, il se peut qu’une moyenne arithmétique accompagnée d’un écart type se révèle plus appropriée.

Lorsqu’une CIp ou une CL50 donnée déborde des limites de contrôle, il faut mettre en doute la sensibilité des organismes soumis à l’essai ainsi que la valeur et la précision du système d’essai. Comme cette situation peut se produire dans 5 % des cas, du fait du hasard seulement, une CIp ou CL50 qui s’inscrit en dehors des limites ne signifie pas nécessairement que la sensibilité des organismes d’essai ou que la précision des données toxicologiques soient en cause. Il s’agit plutôt d’un avertissement qu’il pourrait y avoir un problème.

On devrait vérifier à fond l’état de santé de l’élevage (cf. 2.3.11) ainsi que toutes les conditions d’élevage et d’essai. Selon les constatations, on pourrait devoir répéter l’essai de toxicité de référence, obtenir de nouveaux géniteurs et/ou établir de nouveaux élevages avant d’entreprendre d’autres essais de toxicité avec des larves de tête-de-boule.

L’utilisation de limites de contrôle n’indique pas nécessairement qu’un laboratoire produit des résultats constants. Un laboratoire produisant des données très variables pour un produit toxique de référence aurait des limites d’alarme très étendues. Une nouvelle donnée pourrait fort bien s’inscrire dans cet intervalle, mais refléter néanmoins une variation indésirable des résultats. Provisoirement, Environnement Canada (1990c) propose un coefficient de variation de 20 ou de 30 % comme limite convenable, laquelle semble appropriée, car des essais interlaboratoires menés dans la région de San Francisco ont révélé un coefficient de variation de 22 %, calculé sur une base logarithmique (le C.V. calculé sur une base arithmétique était de 31 %; Anderson et Norberg-King, 1991). Toutefois, pour établir une limite des variations admissibles des résultats obtenus lors d’essais avec des produits toxiques de référence, il faudrait accumuler davantage de données sur la reproductibilité que les laboratoires canadiens peuvent atteindre lors des essais de sept jours sur la tête-de-boule.

Les solutions mères de phénol devraient être préparées le jour même où elles sont utilisées. On devrait utiliser du sulfate de zinc (généralement de formule ZnSO4 · 7H2O et d’une masse moléculaire égale à 4,398 fois celle du zinc) pour la préparation des solutions mères de zinc, qui devraient être acides (pH de 3 à 4). Ces solutions peuvent être utilisées dès leur préparation ou être conservées dans l’obscurité à une température de 4 ± 2 °C pendant plusieurs semaines jusqu’au moment de l’utilisation. Les concentrations de zinc devraient être exprimées en mg Zn++/L. Les concentrations de chlorure de sodium devraient être exprimées en poids du sel total (NaCl) dans l’eau (g/L).

Les concentrations des produits toxiques de référence dans toutes les solutions mères devraient être mesurées au moyen de méthodes chimiques appropriées (p. ex., APHA et al., 1989 et 2005). Au moment de la préparation des solutions d’essai, on devrait prélever des aliquotes au moins dans la solution témoin et dans les solutions à teneur supérieure, moyenne et inférieure; ces aliquotes devraient être analysées immédiatement ou stockées pour analyse future, au cas où la CIp serait atypique (c’est-à-dire à l’extérieur des limites de contrôle). Si elles sont stockées, on devrait les tenir dans l’obscurité, à une température de 4 ± 2 °C. Les solutions de zinc et de phénol devraient être préservées avant d’être stockées (APHA et al., 1989 et 2005). Les aliquotes stockées nécessitant un dosage devraient être traitées sans délai aussitôt l’essai de toxicité terminé. Il est souhaitable de mesurer les concentrations dans les mêmes solutions à la fin de l’essai, une fois terminées les observations biologiques. Le calcul de la CIp devrait se fonder sur la moyenne géométrique des concentrations mesurées, si ces dernières diffèrent sensiblement (c.-à-d. de 20 % ou plus) des concentrations nominales et si on peut se fier à l’exactitude des analyses chimiques.

4.7 Considérations juridiques

On doit veiller à ce que les échantillons prélevés et soumis à l’essai soient recevables en preuve en cas de poursuites judiciaires. Pour cela, les échantillons doivent : être représentatifs de la matière ou de la substance échantillonnée; ne pas être contaminés par des substances ou des matières étrangères; être identifiés avec précision (date, heure et lieu d’origine); être consignés clairement pour assurer la continuité de la preuve; et être analysés le plus tôt possible après leur prélèvement. Les responsables de l’exécution de l’essai et de la rédaction du procès-verbal doivent assurer la continuité de la preuve en cas de procédures judiciaires (McCaffrey, 1979) ainsi que l’intégrité des résultats des essais.

Section 5 Modes opératoires particuliers pour l’essai de produits chimiques

La présente section énonce des instructions particulières pour l’essai de produits chimiques, qui s’ajoutent aux modes opératoires exposés dans la section 4.

5.1 Propriétés, étiquetage et stockage des échantillons

On devrait obtenir des renseignements sur les propriétés du produit chimique à expérimenter, notamment sa solubilité dans l’eau, sa tension de vapeur, sa stabilité chimique, ses constantes de dissociation, son coefficient de partage entre le n-octanol et l’eau ainsi que sa biodégradabilité. Si une fiche signalétique est disponible sur le produit, on devrait la consulter. Lorsque la solubilité dans l’eau d’un produit chimique est douteuse, les méthodes admissibles utilisées antérieurement pour la préparation de solutions aqueuses de ce produit devraient être obtenues et consignées. Il faudrait également obtenir et consigner d’autres renseignements disponibles tels que la formule développée, le degré de pureté, la nature et le pourcentage des impuretés et additifs significatifs, les précautions à prendre pour la manutention et les estimations de la toxicité pour les humainsNote de bas de page 36. On devrait connaître une méthode acceptable d’analyse de la substance chimique dans l’eau aux concentrations d’essai prévues ainsi que les données relatives à la précision et à l’exactitude de l’analyse.

Une estimation de la plus faible concentration à laquelle la ou les substances d’essai exercent un effet létal aigu sur les larves de tête-de-boule est utile pour déterminer les concentrations qu’il convient d’utiliser dans l’essai de toxicité chronique (7 jours). Cette estimation est fournie par les résultats d’un essai statique de détermination de la CL50 après 48 h (cf. sous-section 4.5 et annexe E), qui est mené à 25 ± 1 ̊C avec la même eau témoin/de dilution qui doit servir à l’essai de toxicité chronique. Des larves élevées dans des conditions similaires ou identiques aux conditions d’élevage des organismes qui seront utilisés dans l’essai de toxicité de sept jours devraient être employées pour mesurer la létalité aiguë (après 48 h) du produit chimique étudié. Les autres conditions et méthodes d’essai devraient être le plus possible similaires à celles de l’essai de toxicité chronique.

Dès réception, les contenants doivent être fermés hermétiquement et codés ou étiquetés (p. ex., nom du produit, fournisseur et date de réception). Les conditions de stockage (p. ex., température et protection contre la lumière) sont souvent dictées par la nature du produit. Les modes opératoires normalisés pour la manipulation et le stockage des produits chimiques devraient être respectés.

5.2 Préparation des solutions d’essai

Pour préparer les solutions d’essai d’un produit chimique, on ajoute normalement des aliquotes d’une solution mère à de l’eau témoin/de dilution. Par ailleurs, pour les solutions très concentrées ou les grands volumes, on peut ajouter des quantités prépesées (à l’aide d’une balance de précision) du produit chimique dans de l’eau témoin/de dilution, de façon à obtenir les teneurs nominales à expérimenter. Si l’on utilise une solution mère, la concentration et la stabilité de la substance à expérimenter dans cette solution devraient être déterminées avant le commencement de l’essai. On devrait protéger de la lumière les solutions mères susceptibles de photolyse. Il faut préparer les solutions mères instables journellement ou aussi souvent que cela est nécessaire pour maintenir des concentrations constantes pour chaque renouvellement des solutions d’essai.

On devrait préparer les solutions par dissolution de la substance chimique dans l’eau témoin ou de dilution. Dans le cas des substances qui ne se dissolvent pas facilement dans l’eau, les solutions mères peuvent être préparées au moyen de la technique de la colonne génératrice (Billington et al., 1988; Shiu et al., 1988) ou, comme second choix, par dispersion ultrasoniqueNote de bas de page 37. On ne devrait pas utiliser de solvants organiques, d’émulsifiants ou de dispersants pour accroître la solubilité du produit chimique, sauf dans les cas où ces substances pourraient être incorporées avec ce produit dans des formulations commerciales d’usage normal. Le cas échéant, on doit préparer une solution témoin supplémentaire renfermant la même concentration d’agent solubilisant que la concentration la plus concentrée du produit chimique à expérimenter. Ces agents ne devraient pas dépasser 0,1 mL/L dans toute solution d’essai. Lorsqu’on utilise des solvants, il est préférable d’utiliser les produits suivants (EPA, 1985b) : diméthylformamide, triéthylène glycol, méthanol, éthanol et acétone.

5.3 Eau témoin/de dilution

L’eau témoin/de dilution peut être de l’eau reconstituée, de l’eau douce dans laquelle les poissons adultes ont été élevés et les larves ont éclos (eau naturelle, souterraine ou de surface, ou eau municipale déchlorée en dernier recours), une eau naturelle non contaminée d’une autre source dont l’aptitude à être utilisée dans des essais de sept jours portant sur la croissance et la survie de larves de tête-de-boule a déjà été démontrée par le laboratoire, ou un échantillon d’un milieu récepteur si une situation locale présente un intérêt particulier. Le choix de l’eau témoin/de dilution dépend de l’objet de l’essai.

Lorsqu’un haut degré de normalisation est nécessaire (p. ex., lorsqu’il faut calculer la toxicité d’un produit chimique dans plusieurs installations d’essai et comparer les valeurs obtenues), il faudrait préparer de l’eau reconstituée douce (d’une dureté de 40 à 48 mg/L (CaCO3) et d’un pH de 7,2 à 7,5) et l’utiliser pour toutes les dilutions et comme eau témoin (EPA, 1985). Des instructions pour la préparation de cette eau sont présentées dans la sous-section 4.6 (cf. note 35).

Lorsqu’on doit évaluer l’effet toxique d’un produit chimique sur un milieu récepteur particulier, on pourrait prélever des échantillons de ce milieu, à l’abri de l’influence du produit, et les utiliser comme eau témoin/de dilutionNote de bas de page 38,Note de bas de page 39,Note de bas de page 40. Par exemple, il peut s’agir d’évaluer l’effet toxique réel ou potentiel, sur une nappe d’eau particulière, de déversements ou d’applications intentionnelles de substances chimiques (p. ex., vaporisation d’un pesticide). Si une eau « d’amont » est utilisée comme eau témoin/de dilution, une solution témoin distincte doit être préparée à partir de la source d’eau du laboratoire qui est normalement utilisée pour les essais de toxicité de sept jours sur la tête-de-boule et qui est reconnue apte à produire de manière régulière des résultats d’essai validesNote de bas de page 38.

On peut aussi se servir de l’eau naturelle non contaminée du laboratoire pour évaluer l’effet toxique d’un produit chimique sur un milieu récepteur particulier, notamment lorsque le prélèvement et l’utilisation du milieu récepteur posent des problèmes pratiques. L’eau normale du laboratoire pourrait aussi convenir en d’autres circonstances (p. ex., évaluation préliminaire ou intralaboratoire de la toxicité d’un produit chimique).

5.4 Observations et mesures

Outre les observations relatives à la toxicité prévues dans la sous-section 4.4, il faut procéder à diverses observations et mesures au cours des essais de produits chimiques.

Pendant la préparation des solutions et à chacune des périodes d’observation prescrites, on devrait examiner chaque solution afin d’observer la présence et l’évolution du produit chimique (p. ex., odeur, couleur et opacité de la solution, précipitation ou floculation du produit chimique). Toute observation devrait être consignée.

Il est souhaitable et recommandé d’analyser les solutions d’essai afin de déterminer les concentrations du produit chimique auxquelles les poissons sont exposésNote de bas de page 41. Pour ce faire, on devrait prélever des aliquotes dans les solutions d’essai à teneur supérieure, moyenne et inférieure et dans les solutions témoins. À tout le moins, il faudrait analyser séparément des échantillons prélevés au commencement et à la fin de l’intervalle de renouvellement, la première et la dernière journée de l’essai. Ces échantillons devraient être préservés, stockés et analysés au moyen des meilleures méthodes éprouvées dont on dispose pour établir la concentration du produit chimique visé en solution aqueuse.

Si les mesures chimiques indiquent que les concentrations ont diminué de plus de 20 % durant l’essai, on devrait évaluer à nouveau la toxicité du produit chimique au moyen d’un essai où les solutions sont renouvelées plus fréquemment qu’une fois par jour. Si nécessaire, on pourrait envisager d’effectuer un essai à renouvellement continu, mais il faudrait alors prévoir une conception spéciale en fonction de la faible taille des larves (McKim, 1985).

Tous les échantillons devraient être préservés, stockés et analysés selon des méthodes éprouvées, en veillant à ce que les limites de détection conviennent pour établir la concentration du produit chimique visé en solution aqueuse. Dans tous les essais au cours desquels on mesure les concentrations, la toxicité devrait être calculée et exprimée en fonction des concentrations mesurées, sauf s’il y a des bons motifs de croire que les mesures chimiques ne sont pas exactes. Aux fins de ces calculs, on devrait caractériser chaque solution d’essai par la moyenne géométrique des concentrations mesurées auxquelles les organismes ont été exposés.

5.5 Résultats et calculs

Les paramètres de toxicité considérés dans les essais de produits chimiques sont habituellement la CL50 à la fin de l’essai et la CIp pour la biomasse (croissance) [cf. sous-section 4.5].

Lorsqu’on utilise un témoin pour le solvant, l’essai est invalidé si, que ce soit dans les solutions témoins du solvant ou les solutions constituées uniquement d’eau témoin non traitée, l’incidence combinée (c’est-à-dire pour toutes les répétitions du même traitement) et cumulative (dans le temps) des poissons morts, moribonds et présentant une perte d’équilibre ou d’autres signes d’un comportement de nage manifestement atypique est supérieure à 20 %. L’essai est également invalidé si, que ce soit dans le témoin du solvant ou le témoin non traité du laboratoire, le poids sec final moyen combiné (pour toutes les répétitions du même traitement) des poissons témoins survivants, déterminé par séchage et pesée, n’atteint pas 250 µg. Dans les sous-sections 4.3 et 4.5, on expose les critères (identiques) de validité des essais pour les solutions d’eau témoin ou de dilution non traitées faisant partie de tout essai employant un solvant et un témoin du solvant, qui s’appliquent ici également.

Section 6 Modes opératoires particuliers pour l’essai d’échantillons d’effluents, d’élutriats et de lixiviats

La présente section énonce des instructions particulières pour le prélèvement, la préparation et l’essai d’échantillons d’effluents, d’élutriats et de lixiviats; ces instructions viennent s’ajouter aux modes opératoires exposés dans la section 4.

6.1 Prélèvement, étiquetage, transport et stockage des échantillons

Les récipients utilisés pour le transport et le stockage des échantillons ou sous-échantillons d’effluents, d’élutriats et de lixiviats doivent être fabriqués de matériaux non toxiques. On recommande des récipients en polyéthylène ou polypropylène compressible utilisés pour le transport d’eau potable (p. ex., les contenants de plastique RelianceMC), vu que leur volume peut être réduit pour les placer dans une glacière pour le transport, et que le vide d’air est réduit au minimum lorsqu’une partie de l’échantillon est retiré au laboratoire pour l’essai de toxicité ou des analyses chimiques. Les récipients doivent être neufs ou avoir été nettoyés à fond et rincés avec de l’eau non contaminée. Ils devraient également être rincés avec l’échantillon à recueillir. Il faudrait les remplir de manière à réduire le vide d’air.

La plupart des essais sur des effluents, des lixiviats ou des élutriats ne sont pas faits sur place, mais dans un laboratoire à milieu contrôlé. L’une des deux méthodes ou approches suivantes doit être utilisée pour chaque essai exécuté hors site.

  1. Un échantillon unique peut être prélevé pour servir pendant toute la durée de l’essai. Il faut cependant le répartir dans au moins trois contenants (c.-à-d., trois sous-échantillons ou plus) au moment du prélèvement, ou de la préparation s’il s’agit d’un élutriat. Si l’on a recours à cette méthode, le premier sous-échantillon doit servir au démarrage de l’essai (jour 0) et au renouvellement des solutions aux jours 1 et 2, le deuxième sous-échantillon, au renouvellement des solutions aux jours 3 et 4, et le troisième sous-échantillon, au renouvellement des solutions aux jours 5 et 6.
  2. Lorsque l’on sait ou que l’on prévoit que la toxicité des eaux usées sera radicalement modifiée en cas de délai de 7 à 10 jours entre le prélèvement et l’utilisation, il faut prélever des échantillons frais (ou préparer des élutriats frais) à au moins trois reprises au cours de l’essai, à intervalles de deux ou trois jours ou moins. Si les trois échantillons sont prélevés à deux ou trois jours d’intervalle (p. ex., le lundi, le mercredi et le vendredi), le premier doit être utilisé au démarrage de l’essai (jour 0) et pour les renouvellements les jours 1 et 2; le deuxième, pour les renouvellements les jours 3 et 4; et le troisième, pour les renouvellements les jours 5 et 6. Dans le cas d’eaux usées que l’on sait ou que l’on prévoit être particulièrement instables, on pourrait, si l’essai n’est pas exécuté sur place, prélever un échantillon chaque jour, sept jours de suite, et utiliser chaque échantillon dans l’essai pendant un jour seulement, en suivant l’ordre de prélèvement.

Lorsque les essais sont faits dans des installations à milieu contrôlé situées sur place (p. ex., dans un laboratoire mobile ou industriel), les échantillons devraient être recueillis tous les jours et utilisés dans un délai de 24 h pour le renouvellement quotidien des solutions d’essai (EPA, 1989, 1994 et 2002).

Lorsque la méthode 1 décrite ci-dessus est utilisée, un échantillon de 60 à 80 L suffit pour exécuter hors site un essai à concentrations multiples (p. ex., 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2 et 1,6 %) et les analyses associées courantes de l’échantillon. Avec la méthode 2, un volume de 20 à 25 L par échantillon (pour chacun des trois échantillons requis pour l’essai) devrait être suffisant dans la plupart des cas. Il est bien entendu que des volumes supérieurs seraient requis si les mêmes échantillons devaient servir à d’autres essais de toxicité (p. ex., l’essai de sept jours sur Ceriodaphnia dubia selon EC, 2005). Les volumes requis sont moindres pour les essais effectués à une seule concentration (cf. 4.5). Au moment du prélèvement, chaque contenant doit être rempli, fermé hermétiquement et étiqueté ou codé. Les renseignements qui doivent figurer sur l’étiquette comprennent au moins le type et la source de l’échantillon, la date et l’heure du prélèvement ainsi que le nom du préposé à l’échantillonnage. Les échantillons reçus par le laboratoire dans des contenants non étiquetés ou non codés ne devraient pas être retenus pour les essais. Il en est de même pour ceux reçus dans des contenants partiellement remplis ou non scellés, car les substances toxiques volatiles peuvent alors s’échapper dans le vide d’air. Par ailleurs, lorsqu’on sait que la volatilité ne pose pas de problème, ces échantillons pourraient être soumis à l’essai, à la discrétion de l’expérimentateur.

L’essai des échantillons d’effluents et de lixiviats devrait être entrepris le plus tôt possible après leur prélèvement. Chaque fois que possible, tout échantillon soumis à un essai devrait être utilisé à l’intérieur de un jour et l’essai doit commencer pas plus tard que trois jours après le prélèvement. Les échantillons de sédiments, de sol ou d’autre matériau solide prélevés pour l’extraction aqueuse et l’essai de l’élutriat devraient aussi faire l’objet d’un essai le plus tôt possible, au plus tard dans les dix jours suivant leur réception. L’essai des élutriats doit commencer dans les trois jours après leur préparation ou dans les délais indiqués dans le règlement ou le protocole expérimental pertinent.

Il faut s’efforcer de garder tous les échantillons d’effluents ou de lixiviats au frais (1 à 7 °C, de préférence à 4 ± 2 °C) pendant toute la durée du transport. Au moment du prélèvement, les échantillons chauds (plus de 7 °C) doivent être refroidis à 1 à 7 °C avec de la glace hydrique (et non de la glace sèche) ou des sacs réfrigérants. Si nécessaire, remplir le contenant utilisé pour le transport des échantillons avec la quantité voulue de glace hydrique, de sacs réfrigérants ou autre moyen de réfrigération pour maintenir leur température entre 1 et 7 °C durant le transport. Les échantillons ne doivent pas geler pendant le transport ou le stockage.

À l’arrivée au laboratoire, il faut mesurer et inscrire la température de l’échantillon ou de l’un des sous-échantillons éventuellement prélevés (garder hermétiquement fermés). La température d’une aliquote d’effluent ou de lixiviat requise à ce moment peut être ramenée immédiatement ou au cours de la nuit à 25 °C en vue de l’essai. Les aliquotes d’échantillon ou de sous-échantillons restantes destinées au renouvellement des solutions doivent être conservées à l’obscurité dans des contenants hermétiquement fermés, sans vide d’air, à la température de 4 ± 2 °C.

Sauf indication contraire, la température pendant le transport et le stockage des élutriats ainsi que des échantillons destinés à l’extraction aqueuse et à l’essai ultérieur de l’élutriat devrait être conforme aux indications ci-dessus s’appliquant aux échantillons d’effluents ou de lixiviats.

6.2 Préparation des solutions d’essai

Chaque récipient ayant servi à recueillir un échantillon ou sous-échantillon doit être agité vigoureusement juste avant de le vider afin d’assurer la remise en suspension des solides décantables. La teneur en oxygène dissous et le pH de chaque échantillon ou sous-échantillon doivent être mesurés juste avant son utilisation. Au besoin, chaque solution d’essai devrait être préaérée (cf. 4.3.1) avant de répartir les aliquotes dans les récipients d’essai.

Il n’est en général pas nécessaire ni recommandé de filtrer les échantillons ou les sous-échantillons. Cependant, s’ils renferment des organismes indigènes qui pourraient être confondus avec les organismes d’essai, s’y attaquer ou leur faire concurrence pour la nourriture, les échantillons ou les sous-échantillons doivent être filtrés à travers un tamis à mailles de 60 µm avant d’être utilisés (EPA, 1989, 1994 et 2002). La filtration pourrait causer l’extraction de matières solides en suspension qui sont représentatives de l’échantillon ou du sous-échantillon et qui pourraient accroître en partie ou modifier sa toxicité. Lorsqu’on craint que cela se produise, on devrait conduire un second essai en parallèle avec une portion non filtrée de l’échantillon ou du sous-échantillon.

6.3 Eau témoin/de dilution

Pour les essais réalisés sur des échantillons d’effluents ou de lixiviats à des fins de surveillance ou de contrôle de la conformité à un règlement, on devrait utiliser comme eau témoin/de dilution, soit une eau (source d’eau) de laboratoire qui, d’après les essais du laboratoire, permet d’obtenir régulièrement des résultats valides dans des essais de sept jours portant sur la survie et la croissance de larves de tête-de-boule, soit un échantillon de milieu récepteur. Étant donné que les résultats pourraient varier selon la source d’eau employée, on doit fixer les objectifs de l’essai avant d’effectuer ce choix. Il faudrait également tenir compte des difficultés et des coûts liés au prélèvement et au transport d’échantillons de milieu récepteur destinés à être utilisés comme eau témoin/de dilution.

L’utilisation du milieu récepteur comme source d’eau témoin/de dilution pourrait être souhaitable dans certains cas, lorsqu’il faut recueillir des renseignements au sujet de l’effet toxique potentiel d’un effluent, d’un lixiviat ou d’un élutriat sur un milieu récepteur particulier (cf. sous-section 5.3 et les notes associées 38 à 40 où figurent des renseignements qui s’appliquent également ici). Un bon exemple serait un essai en vue de détecter un effet sublétal en périphérie d’une zone de mélange, compte tenu d’exigences réglementaires propres à un lieu donné. Les conditions de prélèvement, de transport et de stockage des échantillons de milieux récepteurs devraient être conformes aux dispositions de la sous-section 6.1. L’eau de surface devrait être filtrée pour en éliminer les organismes conformément aux instructions données en 6.2.

Si un échantillon de milieu récepteur prélevé en amont doit être utilisé comme eau témoin/de dilution, il faut préparer une solution témoin distincte avec l’eau du laboratoire normalement utilisée pour exécuter l’essai de toxicité de sept jours sur les larves de tête-de-boule (c.-à-d. eau d’élevage ou autre eau appropriée du laboratoire; cf. sous-section 4.1). La survie et la croissance (c.-à-d. la biomasse) des poissons (cf. sous-section 4.5) dans la solution d’eau témoin du laboratoire doivent être comparées à celles des poissons placés dans l’échantillon d’eau du milieu récepteur « amont ».

Pour les essais qui nécessitent un haut degré de normalisation, on peut utiliser une eau reconstituée d’une dureté déterminée (cf. sous-section 4.6, note 35) comme eau témoin/de dilution. Cela peut être approprié notamment dans les études visant à corréler les données toxicologiques relatives à différents types ou sources d’effluents, de lixiviats ou d’élutriats lorsque ces données sont produites par divers établissements ou qu’elles le sont par un seul établissement où la qualité de l’eau est variable. Dans de tels cas, il est souhaitable de minimiser toute variation attribuable à des différences des caractéristiques chimiques de l’eau de dilution.

6.4 Conditions de l’essai

Normalement, les échantillons d’effluents, de lixiviats ou d’élutriats ne sont ni filtrés ni agités durant les essais. Cependant, la présence en forte concentration de matières solides inorganiques ou organiques en suspension dans un échantillon pourrait être particulièrement stressante pour les larves de poissons et peut avoir un effet létal aigu même chez de jeunes poissons, si les concentrations sont assez élevées (p. ex., 2000 mg/L et plus, Noggle, 1978; McLeay et al., 1987; Servizi et al., 1987; Hall et Hall, 1989). En outre, des concentrations élevées de matières biologiques dans certains types d’effluents traités pourraient accroître la toxicité des échantillons à cause de la production d’ammoniac ou de nitrites (Servizi et Gordon, 1986). On peut réaliser parallèlement un essai additionnel lorsqu’on craint un accroissement de la toxicité par suite de la présence en concentration élevée de matières décantables ou en suspension dans les échantillons d’effluents, d’élutriats ou de lixiviats et lorsque la recherche a pour objet de quantifier la toxicité attribuable aux matières contenues dans les échantillons. Pour ce second essai, on devrait utiliser une partie de l’échantillon traitée par filtration ou par décantation afin d’éliminer les matières solides, mais la démarche adoptée devrait être identique par ailleurs.

6.5 Observations et mesures

On doit déterminer la mortalité à intervalles de 24 h et le poids sec moyen à la fin de l’essai de sept jours, conformément aux instructions données dans la sous-section 4.4.

La couleur, la turbidité, l’odeur et l’homogénéité (c.-à-d., la présence de matières flottables ou de solides décantables) de l’échantillon d’effluent, de lixiviat ou d’élutriat devraient être observées au moment de la préparation des solutions d’essai. La précipitation, la floculation, le changement de couleur, le dégagement d’odeur ou d’autres réactions se produisant au moment de la dilution avec l’eau devraient être consignés, comme tous les changements d’aspect des solutions pendant l’essai (p. ex., le moussage, la décantation, la floculation, l’augmentation ou la diminution de la turbidité et les variations de couleur).

Pour les essais portant sur des solutions fortement colorées ou opaques ou sur des échantillons produisant de la mousse dans le récipient d’essai, on devrait utiliser les contenants à fond grillagé mentionnés en 3.3 et en 4.3.4. On devrait alors inspecter les poissons en soulevant le contenant dans son récipient de solution d’essai jusqu’à ce qu’on puisse les voir. Au besoin, on pourrait placer le contenant brièvement dans un récipient d’eau de dilution limpide pour y faire les observations sur la mortalité. L’expérience montre que la brève période de transfert et d’immersion dans un liquide « propre » n’endommage aucunement les poissons et n’affecte pas de manière appréciable les résultats de l’essai de toxicité (Parrott, 1988).

Lorsque les échantillons d’effluent ont une teneur appréciable en matières solides, il est souhaitable de mesurer leur teneur totale en matières en suspension et en matières décantables (APHA et al., 1989 et 2005) dès leur réception; ces renseignements font partie de la description générale de l’effluent et représentent des caractéristiques qui pourraient influer sur les résultats de l’essai de toxicité.

6.6 Résultats et calculs

Les essais de surveillance et de conformité doivent normalement porter sur au moins trois répétitions de l’échantillon ou de sous-échantillons non dilués (ou d’une dilution spécifiée) et au moins trois répétitions de solutions témoins. Selon les exigences réglementaires précisées, les essais de conformité pourraient s’en tenir à une concentration unique (100 % d’eaux usées, sauf indication contraire). Des essais à concentrations multiples pourraient également être exigés à des fins de conformité ou de surveillance. Dans ce cas, la CL50 à la fin de l’essai doit être déterminée tout comme la CIp pour la biomasse (cf. sous-section 4.5).

Les essais de toxicité réalisés à d’autres fins (p. ex., détermination de sources de toxicité à l’intérieur d’une usine, de l’efficacité d’un traitement ou des effets de la modification d’un procédé sur la toxicité des effluents), pourraient, selon les objectifs de l’étude, porter sur une seule concentration (effluent à 100 % ou à une dilution appropriée, ainsi qu’un témoin) ou sur des concentrations multiples. Les essais à concentration unique sont souvent un moyen économique d’établir la présence ou l’absence d’une toxicité mesurable ou de faire une évaluation préliminaire d’un nombre important d’échantillons afin d’établir leur toxicité relative. Les résultats considérés dans ces essais dépendent toujours des objectifs de l’étude, mais ce pourrait être notamment des cotes arbitraires de réussite ou d’échec ou le pourcentage de mortalité après une période appropriée, par exemple sept jours. Des instructions qui s’appliquent ici sont présentées dans la sous-section 4.5 concernant l’analyse statistique et la présentation des résultats pour un ensemble d’essais sur différents échantillons dont chacun est soumis à l’essai à une concentration seulement. Un essai à plusieurs concentrations devrait être effectué lorsqu’une toxicité chronique est prévue et que l’objectif est de déterminer la plus forte concentration d’eau usée qui ne montre pas d’effet toxique chez l’organisme d’essai à l’issue d’une exposition prolongée (c.-à-d. sept jours pour cette méthode d’essai biologique).

Section 7 Modes opératoires particuliers pour l’essai d’échantillons d’eau de milieux récepteurs

Le lecteur trouvera ci-après des instructions pour l’essai d’échantillons de milieux récepteurs, qui viennent s’ajouter aux modes opératoires exposés dans la section 4.

7.1 Prélèvement, étiquetage, transport et stockage des échantillons

Les méthodes de prélèvement, d’étiquetage, de transport et de stockage des échantillons et sous-échantillons d’eau de milieux récepteurs devraient être conformes aux dispositions de la sous-section 6.1. L’essai pour déterminer la toxicité des échantillons ou sous-échantillons devrait débuter le plus tôt possible après le prélèvement, de préférence moins de 1 jour et pas plus de 3 jours après.

7.2 Préparation des solutions d’essai

Les contenants d’échantillonnage devraient être agités avant d’être vidés, afin d’assurer l’homogénéité des échantillons. Les échantillons pouvant contenir des prédateurs ou des concurrents des larves de tête-de-boule devraient être filtrés sur un filet à plancton à mailles de 60 µm avant d’être utilisés. On pourrait faire parallèlement un second essai (avec échantillon non filtré) si l’on pense que la filtration peut influencer la toxicité. Par exemple, la filtration de l’échantillon pourrait avoir éliminé des matières en suspension ou décantables qui sont représentatives de la matière d’essai et qui pourraient en modifier la toxicité pour les organismes d’essai.

7.3 Eau témoin/de dilution

Pour les échantillons d’eau de milieux récepteurs prélevés au voisinage d’un point de rejet d’eaux usées, d’un déversement de substances chimiques ou d’une autre source ponctuelle de contamination possible, on peut prélever simultanément de l’eau en amont et l’utiliser comme eau témoin et diluant pour les échantillons d’aval (voir la sous-section 5.3, y compris les notes associées 38 à 40 qui s’appliquent ici également). Cette eau témoin/de dilution devrait être prélevée le plus près possible des sources de contamination en cause, mais en amont ou à l’extérieur de leur zone d’influence, et on devrait la filtrer afin d’en extraire les organismes, comme le prévoit la sous-section 6.2.

Si l’on utilise de l’eau « d’amont » comme eau témoin/de dilution, on doit préparer une solution témoin distincte avec une eau (source d’eau) de laboratoire qui, d’après les essais du laboratoire, permet d’obtenir régulièrement des résultats valides dans des essais de sept jours portant sur la survie et la croissance de larves de tête-de-boule. Les conditions d’essai ainsi que les méthodes de préparation et d’évaluation de chacune des solutions témoins devraient être identiques et conformes aux dispositions des sous-sections 4.1, 5.3 et 6.3.

Des contraintes logistiques, les effets toxiques prévus ou d’autres détails pratiques propres à l’emplacement pourraient empêcher l’utilisation d’eau d’amont comme eau témoin/de dilution. En pareil cas, il y aurait lieu d’utiliser une source d’eau appropriée du laboratoire comme eau témoin et pour toutes les dilutions. Dans le cas des laboratoires qui élèvent leurs propres organismes d’essai, il est recommandé d’utiliser l’eau d’élevage à cette fin. Par contre, si les organismes d’essai sont acquis d’un fournisseur externe, on devrait utiliser une source d’eau de laboratoire reconnue apte à fournir des résultats valides de manière régulière dans les essais réalisés avec cette méthode d’essai biologique. Le pH et la dureté de cette eau de laboratoire pourraient être ajustés pour simuler les caractéristiques correspondantes de l’eau d’amont; la note 40 dans la sous-section 5.3 fournit des conseils utiles à cet égard.

7.4 Observations et mesures

La couleur, la turbidité, le moussage, la précipitation et les autres caractéristiques de l’échantillon et des solutions devraient être observés et mesurés conformément aux dispositions de la sous-section 6.5, aussi bien pendant la préparation des solutions d’essai que pendant les essais eux-mêmes. Ces observations et mesures viennent s’ajouter aux observations et mesures de base sur les organismes prévues dans la sous-section 4.4.

7.5 Résultats et calculs

Les résultats des essais portant sur des échantillons d’eau de milieux récepteurs sont conformes aux options et aux démarches prévues dans les sous-sections 4.5 et 6.6.

L’essai de chaque échantillon de milieu récepteur doit comprendre au moins trois répétitions de solutions de l’eau d’essai non diluée et au moins trois répétitions de la solution témoin. Les paramètres de toxicité (résultats) considérés dans les essais portant sur des milieux récepteurs pourraient souvent se limiter aux données sur la survie et la biomasse des poissons à l’issue d’essais à concentration unique consistant à exposer les larves de tête-de-boule à des échantillons non dilués des milieux récepteurs (cf. sous-section 4.5).

Si les échantillons du milieu récepteur sont susceptibles d’être toxiques, on devrait effectuer un essai à concentrations multiples pour déterminer la CL50 à la fin de l’essai ainsi que la CIp pour la biomasse, conformément à la section 4. Dans cet essai, on devrait utiliser l’échantillon non dilué (à 100 %) comme concentration maximale de la série de concentrations testées.

Certains ensembles d’essai pourraient porter sur une série d’échantillons, comme des eaux de surface provenant d’un certain nombre d’emplacements, chaque échantillon étant soumis à l’essai sans être dilué. Les calculs statistiques et la présentation des résultats de ces essais devraient être conformes aux exigences de la sous-section 4.5.

Section 8 Procès-verbal de l’essai

Le procès-verbal de l’essai doit signaler tout écart qui a pu se produire relativement aux exigences indiquées par « doit », « doivent » ou encore « il faut » dans les sections 2 à 7 de cette méthode d’essai biologique. Si tel a été le cas, le non-respect des exigences doit être détaillé. À partir de ce document, le lecteur doit être en mesure d’établir si les conditions et les méthodes utilisées avant et au cours de l’essai rendent les résultats admissibles pour l’utilisation prévue.

La sous-section 8.1 indique les points qui doivent être couverts dans le procès-verbal d’un essai. La sous-section 8.2 dresse la liste des renseignements qui doivent soit être inclus dans le procès-verbal de l’essai, fournis dans un rapport général séparé, ou gardés en dossier pour cinq ans au minimum. Des programmes de surveillance particuliers ou des protocoles d’essai connexes pourraient exiger que certains éléments d’information énumérés dans la sous-section 8.2 soient mentionnés dans le procès-verbal de l’essai ou que certaines informations relatives à l’essai soient consignées mais seulement en tant que « données à garder en dossier » (p. ex., des détails sur la substance ou la matière soumise à l’essai ou les descriptions précises des modes opératoires et conditions de prélèvement, de manutention, de transport et de stockage des échantillons).

On peut citer les méthodes et conditions qui sont communes à une série continue d’essais (p. ex., essais de toxicité courants à des fins de surveillance ou de conformité) et qui sont conformes aux dispositions du présent document; on peut aussi présenter, en annexe, un rapport général définissant le mode opératoire normalisé.

Les détails concernant la réalisation et les résultats de l’essai qui ne sont pas consignés dans le procès-verbal ou le rapport général doivent être versés aux dossiers du laboratoire et gardés cinq ans au minimum, de sorte qu’on puisse obtenir les renseignements voulus si une vérification de l’essai s’avère nécessaire. Les renseignements à garder en dossier pourraient inclure :

  • la documentation sur la chaîne de possession des échantillons testés à des fins de conformité ou de surveillance;
  • une copie de la documentation sur l’acquisition de l’échantillon ou des échantillons;
  • certaines données des analyses chimiques exécutées;
  • les feuilles de travail pour les observations et mesures consignées au cours de l’essai;
  • les feuilles de travail et le ou les diagrammes de contrôle pour les essais de toxicité réalisés avec le ou les produits de référence;
  • la documentation détaillée sur la provenance et la santé des géniteurs;
  • les renseignements sur le calibrage de l’équipement et des instruments.

Les originaux des feuilles de données doivent être signés et datés par le personnel de laboratoire chargé des essais.

8.1 Exigences minimales pour le procès-verbal

Les points qui suivent doivent être couverts dans le procès-verbal de l’essai.

8.1.1 Substance ou matière soumise à l’essai

  • Brève description du type d’échantillons (p. ex., produit chimique ou substance chimique, effluent, élutriat, lixiviat ou eau du milieu récepteur) et leur volume ou poids (dans le cas d’un produit chimique sec), si ces informations ont été fournies et telles qu’elles ont été fournies au personnel du laboratoire.
  • Détails sur les modalités d’étiquetage ou de codage de chaque échantillon ou sous-échantillon.
  • Dates et heures de prélèvement de l’échantillon/des sous-échantillons et d’arrivée à l’installation d’essai.
  • Dates ou jours d’utilisation des échantillons ou sous-échantillons individuels lors de l’essai.
  • S’il s’agit d’un effluent ou d’un lixiviat, mesure, à l’arrivée à l’installation d’essai, de la température de l’échantillon ou de l’un des sous-échantillons prélevés.
  • Mesure de la teneur en oxygène dissous et du pH de l’échantillon ou des sous-échantillons d’effluent ou d’eau du milieu récepteur, immédiatement avant préparation et utilisation dans l’essai de toxicité.
  • Date de préparation de l’élutriat et description de la méthode utilisée; dates ou jours où des échantillons ou sous-échantillons individuels sont utilisés au cours des essais avec élutriat.

8.1.2 Organismes d’essai

  • Espèces et sources des populations de reproducteurs et des larves.
  • Âge des larves (c’est-à-dire en heures depuis l’éclosion) au début de l’essai, et courte déclaration confirmant que leur vessie natatoire était remplie d’air.
  • Tout signe d’aspect et de comportement inhabituel, ou tout traitement des larves préalablement à l’essai.
  • Données sur le stock de géniteurs (y compris pour les organismes d’essai obtenus de l’extérieur; cf. sous-section 2.2) indiquant l’incidence combinée des poissons morts et malades, déterminée hebdomadairement et exprimée en pourcentage, jusqu’au démarrage de l’essai, y compris pour la période de sept jours précédant le démarrage de l’essai.
  • Taux de mortalité des larves (doit être inférieur à 10 %; sous-section 2.2) pour tout lot d’embryons ou de larves acquis par le laboratoire d’essai.

8.1.3 Installations et appareillage

  • Nom et adresse du laboratoire d’essai.
  • Nom des personnes ayant effectué l’essai.
  • Brève description des récipients d’essai (taille, forme, type de matériau).

8.1.4 Eau témoin/de dilution

  • Type(s) et source(s) de l’eau utilisée comme eau témoin et eau de dilution.
  • Type et quantité de tout produit chimique ajouté à l’eau témoin ou à l’eau de dilution.

8.1.5 Méthode d’essai

  • Mention de la méthode biologique utilisée (p. ex., conforme au présent document).
  • En cas d’ajustement de la dureté, d’ajustement du pH et/ou de filtration, de décantation et de clarification d’un échantillon, d’un sous-échantillon ou d’une solution d’essai, brève description du ou des modes opératoires utilisés.
  • Conception et description de la méthode (si elle est spécialisée) (p. ex., renouvellement des solutions d’essai à intervalles autres que quotidiens; préparation et utilisation d’élutriat; préparation et utilisation de solvants, et dans ce cas, du témoin contenant un solvant).
  • Brève description de la fréquence et de la nature de toutes les observations et de toutes les mesures effectuées au cours de l’essai.
  • Nom du ou des programmes et des méthodes (avec références) utilisés pour le calcul des résultats statistiques.

8.1.6 Conditions et modes opératoires de l’essai

  • Conception et mention de toute modification apportée aux méthodes et conditions spécifiées dans ce document ou des méthodes et conditions qui ont été exclues.
  • Nombre, concentration, hauteur et volume des solutions d’essai, y compris les solutions témoins.
  • Nombre d’organismes par solution d’essai et nombre de solutions de répétition par traitement.
  • Courte description de toute préaération des solutions d’essai (y compris mode, débit et durée).
  • Si des solutions d’essai ont été aérées au cours de l’exposition des organismes, brève description de l’aération avec mention de la durée et du débit d’aération.
  • Date de mise en route de l’essai et date à laquelle il a pris fin.
  • Toutes les mesures requises (cf. sous-section 4.4) de la température, du pH, de l’oxygène dissous (mg/L et pourcentage de saturation) dans les solutions d’essai (y compris les témoins), faites au cours de l’essai.
  • Brève déclaration indiquant si l’essai de toxicité de référence a été exécuté dans les mêmes conditions expérimentales que l’essai du ou des échantillons et précisant tout écart et toute omission des modes opératoires et conditions de l’essai de toxicité de référence spécifiés dans le présent document.

8.1.7 Résultats de l’essai

  • Pour chaque répétition de la solution d’essai (y compris chacune des répétitions du témoin) : nombre de poissons morts et pourcentage correspondant de mortalité dans chaque récipient d’essai, tels qu’ils ont été consignés pour chaque période d’observation de 24 h au cours des sept jours de l’essai.
  • Pour chaque traitement (c’est-à-dire concentration, y compris le traitement témoin) : pourcentage moyen de mortalité (± l’écart type [sx]) à la fin de l’essai.
  • Pour chaque traitement témoin : pourcentage moyen combiné et cumulatif (dans le temps) [± sx] de poissons qui soit étaient morts, soit semblaient moribonds, soit présentaient une perte d’équilibre ou avaient un comportement de nage manifestement atypique, à chaque période d’observation, y compris à la fin de l’essai; poids sec moyen d’une larve survivante à la fin de l’essai (utilisé comme critère de validité de l’essai).
  • Pour chaque traitement, y compris le ou les traitements témoins : biomasse moyenne (± sx) [exprimée en poids sec] à la fin de l’essai (utilisée pour le calcul de la CIp).
  • CL50 (et ses limites de confiance au seuil de 95 %) avec indication de la méthode quantique utilisée; CIp (et ses limites de confiance au seuil de 95 %) pour les données sur la biomasse; détails concernant toute transformation des données qui a été nécessaire et indication de la méthode quantitative utilisée.
  • Toute observation aberrante et la justification de sa suppression.
  • Résultats et durée de tout essai de toxicité fait avec le ou les toxiques de référence soit en même temps que l’essai ou moins de 14 jours avant ou après le début de l’essai, ainsi que valeur de la moyenne géométrique (± 2 fois l’écart type) des résultats obtenus pour le ou les mêmes toxiques de référence par le laboratoire au cours d’essais antérieurs.
  • Toute anomalie dans le déroulement de l’essai, tout problème rencontré, toute mesure qui a été prise.

8.2 Autres exigences

Les sous-sections qui suivent indiquent les éléments qui doivent soit être inclus dans le procès-verbal de l’essai ou dans le rapport général, soit être gardés en dossier pour cinq ans au minimum.

8.2.1 Substance ou matière soumise à l’essai

  • Identité de la ou des personnes qui ont prélevé ou fourni l’échantillon ou les sous-échantillons.
  • Documentation sur les chaînes de possession de l’échantillon et des sous-échantillons et leurs fiches d’inscription.
  • Conditions des échantillons (des sous-échantillons) à l’arrivée et pendant le stockage (p. ex., température, gardés à l’obscurité, dans des récipients scellés).

8.2.2 Organismes d’essai

  • Description des conditions et des méthodes d’élevage, y compris température et éclairage, source et qualité de l’eau, prétraitement de l’eau, fréquence et méthode de renouvellement de l’eau, âges et densité des poissons dans les aquariums d’élevage, type et quantité de substrat.
  • Type, source et mode de préparation des aliments utilisés au cours de l’élevage des organismes d’essai et au cours de l’essai; données sur la valeur nutritive et les contaminants connus des aliments utilisés; modes de préparation et de stockage des aliments; méthode(s) d’alimentation, fréquence d’alimentation et ration.
  • Historique de la population de reproducteurs, y compris les taux hebdomadaires de fécondité jusqu’au démarrage de l’essai, y compris pour la période de sept jours précédant le démarrage de l’essai.
  • Documentation sur tout traitement appliqué à la population de reproducteurs à titre préventif ou pour contrôler une maladie, y compris la nature de la maladie, le pourcentage approximatif du stock touché, les symptômes d’infection et les précisions relatives à tout traitement donné (incluant le type, la dose administrée, la fréquence et les dates de traitement).
  • S’il s’agit d’organismes acquis de l’extérieur (cf. sous-section 2.2), documentation sur les confirmations de l’espèce par un taxinomiste qualifié et le personnel du laboratoire; documentation reçue du fournisseur pour chaque envoi, précisant notamment le stade de développement (c.-à-d. oeuf embryonné ou larve), l’âge et le nombre d’organismes expédiés ainsi que la date et l’heure d’expédition; données sur la température et la teneur en oxygène dissous de l’eau dans le ou les contenants d’expédition au départ et à l’arrivée.

8.2.3 Installations et appareillage

  • Description des systèmes de réglage de l’éclairage et de la température dans l’installation d’essai.
  • Description de tout système d’aération utilisé et de réglage du débit d’air dans les récipients d’essai.
  • Description des méthodes utilisées pour nettoyer ou rincer l’appareillage.

8.2.4 Eau témoin/de dilution

  • Détails sur l’échantillonnage et le stockage si l’eau témoin/de dilution provenait du milieu récepteur « amont ».
  • Détails relatifs à tout traitement de l’eau préalablement à l’essai (p. ex., filtration, stérilisation, chloration/déchloration, ajustement du pH, de la température et/ou de la dureté, dégazage, aération).
  • Toute variable de la qualité de l’eau mesurée avant et/ou pendant l’essai de toxicité (p. ex., teneurs en métaux dissous, ammoniac, pesticides, matières solides en suspension, chlore résiduel, acides humiques et fulviques).

8.2.5 Méthode d’essai

  • Description d’essais antérieurs conduits par le laboratoire avec cette méthode biologique de mesure de la toxicité sur la tête-de-boule.
  • Méthode de préparation et d’entreposage des solutions mères et/ou des solutions d’essai de produits chimiques; description et concentration du ou des solvants utilisés.
  • Méthodes utilisées (avec références) pour les analyses chimiques de l’échantillon ou des solutions d’essai; détails relatifs à l’échantillonnage, la préparation et le stockage de l’échantillon/des solutions d’essai, préalablement aux analyses chimiques.
  • Utilisation d’un ou plusieurs essais préalables ou de détermination de l’ordre de grandeur et leur description.

8.2.6 Conditions et modes opératoires de l’essai

  • Photopériode, source de lumière et intensité lumineuse à proximité de la surface des solutions d’essai.
  • Description de la source et du type de nourriture, et ration (quantité et fréquence).
  • Conditions, méthodes et fréquence des essais de toxicité conduits avec le ou les produits toxiques de référence sur des poissons à l’état larvaire (âgés de <24 h).
  • Mesures de la qualité de l’eau utilisée pour l’élevage, comme eau témoin/de dilution, et dans les aquariums ou réservoirs dans lesquels sont détenus les reproducteurs (cf. 2.3.4).
  • Dureté totale, au début de l’essai, de l’eau témoin/de dilution et au moins de la concentration d’essai la plus élevée, et conductivité de chaque nouvelle solution d’essai préparée.
  • Toute autre mesure chimique de l’échantillon, des solutions mères ou des solutions d’essai (p. ex., teneur en substances chimiques, teneur en matières solides en suspension, conductivité, dureté, alcalinité) effectuée avant et/ou pendant l’essai.       
  • Aspect de l’échantillon ou des solutions d’essai; modifications constatées au cours de l’essai.

8.2.7 Résultats de l’essai

  • Résultats de tout essai de détermination de l’ordre de grandeur effectué aux fins de l’essai définitif.
  • Résultats de toute analyse statistique effectuée avec et sans les valeurs aberrantes; dans le cas des analyses de régression, garder en dossier l’information concernant la taille de l’échantillon (p. ex., le nombre de répétitions par traitement), les estimations des paramètres, avec leur variance ou écart type, tout tableau d’analyse de variance produit, les graphiques des valeurs ajustées et observées de tout modèle utilisé, les résultats des tests de recherche des valeurs aberrantes et les résultats des tests de normalité et d’homoscédasticité.
  • Diagramme de contrôle montrant les résultats les plus récents et les résultats d’essais de toxicité antérieurs conduits avec le ou les produits toxiques de référence.
  • Représentation graphique des données dose-effet.
  • Originaux des feuilles de travail et autres feuilles de données, signés et datés par le personnel de laboratoire ayant conduit l’essai et les analyses connexes.

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Silberhorn, E.M., communication personnelle, 20 janv. 1989. Graduate Center for Toxicology, University of Kentucky, Lexington, Kentucky (1989).

Sprague, J.B., « Measurement of Pollutant Toxicity to Fish, I. Bioassay Methods for Acute Toxicity », Water Res., 3:793-821 (1969).

Stephan, C.E., « Methods for Calculating an LC50 », p. 65-84, in :Aquatic Toxicology and Hazard Evaluation, Amer. Soc. for Testing and Materials, F.L. Mayer et J. L. Hamelink (éd.), Philadelphia, PA, ASTM STP 634 (1977).

Suter, G.W. II, « Letter to the Editor. Seven-day Tests and Chronic Tests », Environ. Toxicol. Chem., 9:1435 (1990).

Suter, G.W. II, A.E. Rosen, E. Linder et D.F. Parkhurst, « Endpoints for Responses of Fish to Chronic Toxic Exposures », Environ. Toxicol. Chem., 6:793-809 (1987).

Ward, R.W., et G.M. DeGraeve, « Acute Residual Toxicity of Several Wastewater Disinfectants to Aquatic Life », Water Resources Bull., 14:696-709 (1978).

Wilde, E.W., R.J. Soracco, L.A. Mayack, R.R. Shealy, T.L. Broadwell et R.F. Steffen, « Comparison of Chlorine and Chlorine Dioxide Toxicity to Fathead Minnows and Bluegill », Water Res., 17: 1327-1331 (1983).

Wolf, E.G., M.J. Schneider, K.O. Schwarzmiller et T.O. Thatcher, Toxicity Tests on the Combined Effects of Chlorine and Temperature on Rainbow (Salmo gairdneri) and Brook (Salvelinus fontinalis) Trout, Battelle Pacific Northwest Labs, Richland, Washington, BNWL-SA-5349, 20 p. (1975).\

Woltering, D.M., « The Growth Response in Fish Chronic and Early Life Stage Toxicity Tests: A Critical Review », Aquatic Toxicol., 5:1-21 (1984).

Zischke, J. A., J.W. Arthur, K. J. Nordlie, R. O. Hermanutz, D.A. Standen et T.P. Henry, « Acidification Effects on Macroinvertebrates and Fathead Minnows (Pimephales promelas) in Outdoor Experimental Channels », Water Res., 17:47-63 (1983).

Annexe A

Membres du Groupe intergouvernemental sur les essais écotoxicologiques (en octobre 2009)

Gouvernement fédéral, Environnement Canada

Suzanne Agius
Programmes de protection du milieu marin
Gatineau (Québec)

Adrienne Bartlett
Institut national de recherche sur les eaux
Burlington (Ontario)

Christian Blaise
Centre Saint-Laurent
Montréal (Québec)

Joy Bruno
Laboratoire des essais environnementaux  du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Craig Buday
Laboratoire des essais environnementaux  du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Ken Doe
Laboratoire des essais environnementaux  de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

Garth Elliott
Laboratoire des essais environnementaux  des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

François Gagné
Recherche sur les écosystèmes fluviaux
Montréal (Québec)

Patricia Gillis
Division de la recherche sur la protection  des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Manon Harwood
Laboratoire des essais environnementaux  du Québec
Montréal (Québec)

Dale Hughes
Laboratoire des essais environnementaux  de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

Paula Jackman
Laboratoire des essais environnementaux  de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

Nancy Kruper
Laboratoire des essais environnementaux  des Prairies et du Nord
Edmonton (Alberta)

Michelle Linssen-Sauvé
Laboratoire des essais environnementaux  du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Danielle Milani
Division de la recherche sur les conséquences  pour les écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Warren Norwood
Division de la recherche sur la protection  des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Heather Osachoff
Laboratoire des essais environnementaux  du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Joanne Parrott
Division de la recherche sur la protection
 des écosystèmes aquatiques
Burlington (Ontario)

Linda Porebski
Programmes de protection du milieu marin
Gatineau (Québec)

Juliska Princz
Laboratoires de S-T
Ottawa (Ontario)

Jessica Rahn
Laboratoires de S-T
Ottawa (Ontario)

Grant Schroeder
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Rick Scroggins
Laboratoires de S-T
Ottawa (Ontario)

Rachel Skirrow
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Troy Steeves
Laboratoire des essais environnementaux de l’Atlantique
Moncton (Nouveau-Brunswick)

David Taillefer
Protection du milieu marin
Gatineau (Québec)

Lisa Taylor (présidente)
Laboratoires de S-T
Ottawa (Ontario)

Sylvain Trottier           
Laboratoire des essais environnementaux du Québec
Montréal (Québec)

Graham van Aggelen
Laboratoire des essais environnementaux du Pacifique et du Yukon
North Vancouver (Colombie-Britannique)

Leana Van der Vliet
Laboratoires de S-T
Ottawa (Ontario)

Brian Walker
Laboratoire des essais environnementaux
du Québec
Montréal (Québec)

Peter Wells (membre émérite)
Service de la conservation de l’environnement
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)

Gouvernement fédéral, Pêches et Océans

Robert Roy
Institut Maurice-Lamontagne
Mont-Joli (Québec)

Gouvernement fédéral, Ressources naturelles

Melissa Desforges
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoires des mines et des sciences minérales
 de CANMET
RNCan
Ottawa (Ontario)

Morgan King
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoires des mines et des sciences minérales
de CANMET
RNCan
Ottawa (Ontario)

Philippa Huntsman-Mapila
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoires des mines et des sciences minérales
de CANMET
RNCan
Ottawa (Ontario)

Carrie Rickwood
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoires des mines et des sciences minérales
de CANMET
RNCan
Ottawa (Ontario)

Bernard Vigneault
Programme Gestion du risque lié aux écosystèmes
Laboratoires des mines et des sciences minérales
de CANMET
RNCan
Ottawa (Ontario)

Gouvernements provinciaux

Richard Chong-Kit
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Kim Hunter
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

David Poirier
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Julie Schroeder
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Toronto (Ontario)

Trudy Watson-Leung
Ministère de l’Environnement de l’Ontario
Etobicoke (Ontario)

Établissements de recherche privés / autres

Christian Bastien
Centre d'expertise en analyse environnementale  du Québec
Sainte-Foy (Québec)

Barbara Bayer
Manitoba Technology Centre, ALS Laboratory
Winnipeg (Manitoba)

Mary Moody
Saskatchewan Research Council
Saskatoon (Saskatchewan)

Jim Somers
Conseil canadien des normes
Ottawa (Ontario)

Annexe B

Adresses de l’administration centrale et des bureaux régionaux d’Environnement Canada

Administration centrale
351, boulevard Saint-Joseph
Place Vincent-Massey
Gatineau (Québec)
K1A 0H3

Région de l’Atlantique
15e étage, Queen Square
45, promenade Alderney
Dartmouth (Nouvelle-Écosse)
B2Y 2N6

Région du Québec
1141, Route de l’église
Québec (Québec)
G1V 3W5

Région de l’Ontario
4905, rue Dufferin, 2e étage
Downsview (Ontario)
M3H 5T4

Région des Prairies et du Nord
Twin Atria no 2, pièce 210
4999, 98e Avenue
Edmonton (Alberta)
T6B 2X3

Région du Pacifique et du Yukon
401, rue Burrard
North Vancouver (C.-B.)
V6C 3S5

Annexe C

Utilisation d’artémias pour l’alimentation de la tête-de-boule

On peut acheter des oeufs d’artémia dans les magasins de fournitures pour aquariums et dans la plupart des animaleries. On trouve également dans le commerce des systèmes dont l’utilisation est recommandée pour l’éclosion des oeufs d’artémia, qui se présentent généralement sous la forme d’un sac en plastique de forme allongée et de sels pour obtenir de l’eau d’une salinité de 15 mg/kg pour l’élevage de ces crustacés. Des instructions pour l’utilisation de l’appareil et pour l’éclosion des oeufs sont incluses. On peut cependant faire éclore les oeufs d’artémia dans presque n’importe quel contenant conique dans lequel l’air pénètre par la partie étroite au fond afin de conserver les oeufs en mouvement continu (Denny, 1987). Nous recommandons de suivre l’étude et les conseils détaillés de l’ASTM (1989) sur l’emploi des artémias.

Selon l’appareillage employé, le préparateur concentre en général les nauplius d’artémia éclos dans leur eau d’élevage avant de les prélever en enlevant brièvement (temporairement) la source d’air. Pour l’alimentation durant l’essai de toxicité, il faudrait rincer les crevettes dans de l’eau douce afin d’éviter d’ajouter du sel dans les solutions d’essai. Le concentré de nauplius d’artémia dans leur milieu d’élevage devrait être rincé dans de l’eau douce à 25 ̊C dans une ampoule à décantation et reposer ensuite pendant deux minutes, au cours desquelles certains des oeufs non encore éclos pourraient remonter à la surface. Le concentré décanté de nauplius est ensuite transféré dans un petit bécher ou contenant dont le fond est muni d’un filet à mailles de 20 µm, puis remis en suspension avant d’être distribué aux poissons à l’aide d’une pipette à répétition ou d’un compte-gouttes (Neville, 1989). En général, de 0,05 à 0,1 mL du concentré, c’est-à-dire une ou deux gouttes, suffisent pour une ration alimentaire destinée à un récipient d’essai contenant dix larves de poisson. Cette ration devrait contenir de 700 à 1000 nauplius (Neville, 1989). Lors de la mise au point du protocole, il faudrait procéder à une vérification afin de déterminer combien de gouttes de concentré sont nécessaires pour fournir entre 700 et 1000 nauplius par la technique particulière utilisée dans le laboratoire (pour ce faire, on estime le nombre contenu dans une aliquote au microscope, au moyen d’un hémocytomètre ou de tout autre dispositif approprié).

Il est essentiel que tous les récipients d’essai reçoivent la même quantité de nourriture et il faut mettre en place des techniques normalisées afin de s’en assurer, par exemple mélanger la suspension dans le petit bécher et déterminer une durée et une position normalisées pour remplir le compte-gouttes et distribuer les nauplius. En outre, on devrait procéder occasionnellement à des inspections, en particulier lorsqu’on commence à effectuer l’essai dans un laboratoire, afin de s’assurer qu’il reste toujours un léger excédent de nauplius dans les récipients durant le jour.

Deux distributions de nourriture chaque jour selon cette méthode devraient garantir une croissance quasi maximale, si l’une des rations est distribuée tôt le matin. Il est établi que deux rations produisent une meilleure croissance des larves qu’une seule ration, quoique la différence soit moins sensible si la ration unique est copieuse (Silberhorn, 1989). Trois rations ne produisent pas de résultats supérieurs sur le plan de la croissance. La croissance augmente en fonction du nombre de nauplius par jour jusqu’à un plateau se situant aux environs de 2000 nauplius par jour.

Dans le cas des aquariums contenant de grandes quantités de larves de tête-de-boule, il serait nécessaire d’augmenter le volume de concentré d’artémias en conséquence. Si l’on y dispense les artémias avec un flux continu d’eau fraîche, il n’est pas nécessaire de les rincer dans de l’eau douce avant de les distribuer.

Étant donné que les larves de tête-de-boule sont très sensibles et que les artémias constituent leur seule source de nourriture durant l’essai, les contaminants présents dans cette nourriture pourraient poser un problème réel, car leur action pourrait se combiner à celle des substances toxiques à expérimenter et fausser les résultats. Par conséquent, on devrait veiller particulièrement à utiliser des oeufs d’artémia qui ont, d’après des mesures, une faible teneur en contaminants, particulièrement en composés organochlorés persistants. L’EPA (1989 et 2002) recommande l’analyse chimique de chaque nouveau lot d’oeufs d’artémia et des teneurs maximales de 0,15 µg/g (poids frais) pour le chlore organique total et de 0,30 μg/g (poids frais) pour les pesticides organochlorés et les BPC ensemble. Elle recommande en outre d’utiliser des oeufs d’artémia provenant du Brésil ou de la Colombie, car ils ont de faibles teneurs en contaminants, mais indique également une source américaine (EPA, 1989 et 2002). Comme les sources et les fournisseurs sont différents pour les artémias disponibles sur le marché canadien, nous ne les mentionnons pas ici. Les meilleurs indices de qualité seront fournis par la mesure des contaminants dans les oeufs de sources différentes, par le taux de succès de l’éclosion des artémias et de la croissance des têtes-de-boule, et par l’échange d’informations à ce sujet entre les laboratoires.

La qualité nutritive des artémias peut également varier selon leur origine. Ce facteur est aussi difficile à évaluer de façon continue que la contamination; pour ce faire, il conviendrait de consigner les informations sur les sources et le succès de l’élevage et de partager entre laboratoires les informations sur les valeurs nutritives mesurées.

Dans le cas des têtes-de-boule jeunes et adultes, on pourrait utiliser d’autres aliments que des artémias congelées. On pourrait obtenir des résultats satisfaisants ou supérieurs avec d’autres sortes d’invertébrés recueillis à l’état sauvage ou élevés, ou avec de la viande hachée fraîche ou congelée; toutefois, les artémias congelées sont pratiques et leur rendement est éprouvé.

Annexe D

Série logarithmique de concentrations convenant aux essais de toxicitéNote de bas de page 42

Colonne (nombre de concentrations comprises entre 100 et 10, ou entre 10 et 1) Note de bas de tableau a.1
1 2 3 4 5 6 7
100 100 100 100 100 100 100
32 46 56 63 68 72 75
10 22 32 40 46 52 56
3,2 10 18 25 32 37 42
1,0 4,6 10 16 22 27 32
  2,2 5,6 10 15 19 24
  1,0 3,2 6,3 10 14 18
    1,8 4,0 6,8 10 13
    1,0 2,5 4,6 7,2 10
      1,6 3,2 5,2 7,5
      1,0 2,2 3,7 5,6
        1,5 2,7 4,2
        1,0 1,9 3,2
          1,4 2,4
          1,0 1,8
            1,3
            1,0

 

Annexe E

Analyse de la mortalité en vue de l’estimation de la concentration létale

L’essai de croissance et de survie d’une durée de sept jours sur des larves de tête-de-boule est conçu pour être un essai sublétal sensible et significatif, car les premiers stades du cycle biologique sont généralement parmi les plus sensibles dans un essai couvrant l’ensemble du cycle vital. Par conséquent, cet essai vise normalement à calculer la CIp basée sur la biomasse moyenne. Toutefois, la mortalité des larves de tête-de-boule représente un effet relativement sensible dans le cycle biologique et constitue parfois l’effet le plus sensible signalé lors d’une exposition des larves pendant sept jours (Woltering, 1984; McKim, 1985; Suter et al., 1987). Par conséquent, il est utile de disposer aussi d’une estimation ponctuelle de la concentration létale. Celle-ci doit être calculée (si les données le permettent) comme l’un des résultats statistiques de cet essai (cf. sous-section 4.5). On trouvera dans Environnement Canada (2005), à la section 4, d’autres informations utiles pour le calcul de la CL50.

La méthode d’essai décrite dans le présent document, qui porte sur des larves, fournira une valeur de la CL50 bien inférieure aux valeurs habituelles de la CL50 aiguë pour la tête-de-boule que l’on trouve dans les publications scientifiques, car celles-ci ont généralement été déterminées par des essais sur des poissons juvéniles, plus tolérants aux contaminants.

Afin d’estimer la CL50, on combine les données recueillies pour toutes les solutions de chaque concentration d’essai pour une exposition d’une durée donnée correspondant normalement à sept jours, soit à la durée de l’essai. Lorsque la mortalité n’est pas égale ou supérieure à 50 % dans au moins une concentration, il est impossible d’estimer la CL50. Lorsque la mortalité est nulle à une certaine concentration, ce renseignement est appliqué à l’ajustement de la courbe de probit, cette valeur étant associée à un effet de 0 % de mortalité. Cependant, lorsque la mortalité est nulle dans une série de concentrations successives, une seule de ces valeurs devrait être utilisée pour l’évaluation de la CL50; il s’agit du résultat associé à la plus forte concentration, c’est-à-dire celui qui est « le plus près du centre » de l’intervalle de distribution des données. De la même façon, s’il y avait une série de taux de mortalité de 100 % à des concentrations élevées dans un essai, une seule valeur correspondant à un effet de 100 % serait utilisée; une fois encore, ce serait celle qui est « le plus près du centre » de l’intervalle des valeurs, c’est-à-dire l’effet à la plus faible de ces concentrations. L’utilisation d’une seule valeur correspondant à 0 % et d’une seule valeur correspondant à 100 % d’effet s’applique à l’analyse des données par programme informatique ou par établissement manuel d’un graphique (cf. ci-après). L’utilisation de valeurs additionnelles de 0 % ou de 100 % pourrait fausser l’estimation de la CL50.

On peut utiliser différents programmes informatiques pour calculer la CL50 et ses limites de confiance. La section 4 du guide d’Environnement Canada sur les méthodes statistiques applicables aux essais d’écotoxicité (EC, 2005) décrit de façon détaillée les programmes commerciaux facilement accessibles (p. ex., les progiciels de statististique TOXCALC, CETIS, TOXSTAT et SAS) qui devraient être utilisés pour estimer la CL50 chez les larves de tête-de-boule. Le choix des méthodes, y compris les deux méthodes préférées utilisant la régression probit ou logit par la technique du maximum de vraisemblance, est expliqué à la sous-section 4.3 du document susmentionné. La méthode de Spearman-Kärber (Hamilton et al., 1977) sans équeutage (ou avec équeutage minimal) est recommandée seulement dans les cas où les résultats ne peuvent être analysés par les deux méthodes préférées, ou l’une d’elles, et son emploi avec équeutage est déconseillé. Dans les cas où il n’y a pas d’effet partiel, mais seulement un effet à 0 % ou à 100 %, la méthode binomiale est préconisée (cf. EC, 2005, sous-section 4.3, « Choix de méthodes »).

Toute CL50 qui résulte de calculs informatiques devrait être vérifiée au moyen d’un graphique, sur échelle de probabilité logarithmique, du pourcentage de mortalité après un temps d’observation donné (p. ex., 96 h) aux différentes concentrations d’essai (APHA et al., 1989) [cf. exemple à la figure E.1]. Tout écart important entre la CL50 estimée sur ce graphique et la valeur calculée par ordinateur doit être résolu.

Dans l’exemple théorique montré à la figure E.1, dix poissons ont été exposés à chacune de cinq concentrations (1,8, 3,2, 5,6, 10 et 18 mg/L) et une solution témoin (où la mortalité a été nulle). Les pourcentages de mortalité correspondant aux nombres d’organismes morts (0, 2, 4, 9, et 10) ont été inscrits sur le graphique et on a tracé, à l’oeil, la droite de meilleur ajustement. On peut établir la concentration qu’on prévoit être létale pour 50 % des organismes en suivant la ligne pointillée à partir du niveau de 50 % jusqu’à son intersection avec la ligne ajustée, puis en passant à l’axe horizontal pour une estimation de la CL50, soit 5,6 mg/L.

En traçant une droite comme celle de la figure E.1, on devrait attribuer relativement plus d’importance aux points qui sont proches de 50 % de mortalité. On peut se procurer du papier graphique de probabilité logarithmique (« log-probit », comme à la figure E.1) dans toutes les bonnes librairies à vocation technique, ou en commander par leur entremise.

Les programmes informatiques ont donné des estimations très proches de celle fournie par le graphique de la figure E.1, établi à partir de données régulières. Les CL50 (et les limites de confiance à 95 %) étaient les suivantes :

Analyse des probits de Hubert (1987) :

  • 5,56 (4,28-7,21)

Stephan (1977)

  • probit : 5,58 (4,24-7,37)
  • moyenne mobile : 5,58 (4,24-7,33)
  • binomiale : 6,22 (1,8-10)

Méthode de Spearman-Kärber (Hamilton et coll., 1977)

  • équeutage de 0 % : 5,64 (4,38-7,26)
  • équeutage de 10 % : 5,73 (4,34-7,58)
  • équeutage de 20 % : 5,95 (4,34-9,80)

La méthode binomiale n’a pas donné d’estimation des limites de confiance, mais elle a permis de choisir deux concentrations d’essai comme limites extrêmes d’un intervalle à l’intérieur duquel se trouveraient les vraies limites de confiance.

On peut aussi, si on le souhaite, estimer le temps létal 50 (TL50) à une concentration donnée. Pour cela, on trace un graphique semblable à celui de la figure E.1 en portant le logarithme du temps sur l’axe horizontal. Les temps précis à la mort des organismes pourraient être utilisés, mais ils sont rarement connus puisque les solutions d’essai ne sont pas surveillées en permanence. Le pourcentage cumulatif de mortalité aux différentes inspections successives donne des résultats tout à fait satisfaisants pour l’établissement du graphique, et une droite ajustée à l’oeil permet d’estimer les limites de confiance lorsqu’on suit la démarche proposée dans Litchfield (1949).

Figure E.1 Estimation d’une concentration létale 50 par la représentation graphique de la mortalité sur papier de probabilité logarithmique
Estimation d’une concentration létale 50 par la représentation graphique de la mortalité sur papier de probabilité logarithmique
Description longue de la figure E.1

Cette figure constitue une représentation graphique des mortalités (en pourcentages et en probités) à titre de fonction de concentration. Une ligne pleine est tracée pour cadrer avec les points de données indiqués. Une ligne pointillée s'étend horizontalement depuis le point de mortalité de 50 % sur l'axe Y jusqu'à son intersection avec la ligne pleine traçant les points de données. Une deuxième ligne pointillée descend verticalement depuis le point d'intersection jusqu'à l'axe X. Le point d'intersection entre cette ligne verticale et l'axe X représente l'estimation de la concentration létale 50 (CL50).

Lorsque les données le permettent, ces TL50 pourraient être estimés à partir de relevés successifs de la mortalité à intervalles de 24 h. La mortalité observée doit être supérieure à 50 % pour qu’on puisse estimer le TL50.

Ni le TL50 ni le pourcentage de mortalité après de courts intervalles d’exposition ne constituent une méthode fiable pour établir la toxicité définitive; c’est pourquoi des comparaisons qui s’appuient sur ces résultats ne donnent que des indications semi-quantitatives. Toutefois, il pourrait parfois être utile d’indiquer si les substances ou matières soumises à l’essai ont un effet létal rapide ou lent. Ainsi, cela pourrait nous aider à établir si des dépassements de concentrations à court terme sont admissibles par rapport à une limite à long terme prévue dans un règlement. En principe, le fait d’établir un TL50 au lieu d’une CL50 peut conduire à une utilisation encore plus complète des résultats livrés par les essais, et une courbe de létalité qui prend le temps et la concentration comme paramètres pourrait se révéler utile pour l’examen des mécanismes d’effet des substances toxiques (Sprague, 1969; Suter et al., 1987).

Annexe F

Méthodes d’essai biologique et documents d’orientation publiés par la Section de l’élaboration et de l’application des méthodes d’Environnement Canada Note de bas de page 43

Tableau 4a. Méthodes d’essai biologique universelles
Titre de la méthode d’essai ou du document d’orientation Numéro du rapport Date de publication Modifications applicables
Essai de létalité aiguë sur la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/9 Juillet 1990 Mai 1996
Essai de létalité aiguë sur l’épinoche à trois épines (Gasterosteus aculeatus) SPE 1/RM/10 Juillet 1990 Mars 2000
Essai de létalité aiguë sur Daphnia spp. SPE 1/RM/11 Juillet 1990 Mai 1996
Essai de reproduction et de survie du cladocère Ceriodaphnia dubia SPE 1/RM/21
2e édition
Février 2007 --
Essai de croissance et de survie sur des larves de tête-de-boule SPE 1/RM/22 Février 1992 Février 2010
Essai de toxicité sur la bactérie luminescente SPE 1/RM/24 Novembre 1992 --
Essai d’inhibition de la croissance d’une algue d’eau douce SPE 1/RM/25
2e édition
Mars 2007 --
Essai de toxicité aiguë de sédiments chez des amphipodes marins ou estuariens SPE 1/RM/26 Décembre 1992 Octobre 1998
Essai sur la fécondation chez les échinides (oursins verts et oursins plats) SPE 1/RM/27 Décembre 1992 Novembre 1997
Essai de toxicité sur des salmonidés aux premiers stades de leur cycle biologique (truite arc-en-ciel, saumon coho ou saumon de l’Atlantique) SPE 1/RM/28
1re édition
Décembre 1992 Janvier 1995
Essai de toxicité sur des salmonidés (truite arc-en-ciel) aux premiers stades de leur cycle biologique SPE 1/RM/28
2e édition
Juillet 1998 --
Essai de survie et de croissance des larves dulcicoles de chironomes (Chironomus tentans ou Chironomus riparius) dans les sédiments SPE 1/RM/32 Décembre 1997 --
Essai de survie et de croissance de l’amphipode dulcicole Hyalella azteca dans les sédiments SPE 1/RM/33 Décembre 1997 --
Essai de mesure de l’inhibition de la croissance de la plante macroscopique dulcicole Lemna minor SPE 1/RM/37
2e édition
Janvier 2007 --
Essai de survie et de croissance des vers polychètes spionides (Polydora cornuta) dans les sédiments SPE 1/RM/41 Décembre 2001 --
Essais pour déterminer la toxicité de sols contaminés pour les vers de terre Eisenia andrei, Eisenia fetida ou Lumbricus terrestris SPE 1/RM/43 Juin 2004 --
Essai de mesure de la levée et de la croissance de plantes terrestres exposées à des contaminants dans le sol SPE 1/RM/45 Février 2005 --
Essai de mesure de la survie et de la reproduction de collemboles exposés à des contaminants dans le sol SPE 1/RM/47 Septembre 2007 --
Tableau 4b. Méthodes de référence Note de bas de tableau a.2
Titre de la méthode d’essai ou du document d’orientation Numéro du rapport Date de publication Modifications applicables
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/13
1re édition
Juillet 1990 Mai 1996,
décembre 2000
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez la truite arc-en-ciel SPE 1/RM/13
2e édition
Décembre 2000 --
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez Daphnia magna SPE 1/RM/14
1re édition
Juillet 1990 Mai 1996,
décembre 2000
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’effluents chez Daphnia magna SPE 1/RM/14
2e édition
Décembre 2000 --
Méthode de référence pour la détermination de la létalité aiguë d’un sédiment pour des amphipodes marins ou estuariens SPE 1/RM/35 Décembre 1998 --
Méthode de référence servant à déterminer la toxicité des sédiments à l’aide d’une bactérie luminescente dans un essai en phase solide SPE 1/RM/42 Avril 2002 --
Tableau 4c. Documents d’orientation
Titre de la méthode d’essai ou du document d’orientation Numéro du rapport Date de publication Modifications applicables
Document d’orientation sur le contrôle de la précision des essais de toxicité au moyen de produits toxiques de référence SPE 1/RM/12 Août 1990 --
Document d’orientation sur le prélèvement et la préparation de sédiments en vue de leur caractérisation physicochimique et d’essais biologiques SPE 1/RM/29 Décembre 1994 --
Document d’orientation sur la mesure de la précision des essais de toxicité sur sédiment de contrôle dopé avec un produit toxique de référence SPE 1/RM/30 Septembre 1995 --
Guide des essais écotoxicologiques employant une seule espèce et de l’interprétation de leurs résultats SPE 1/RM/34 Décembre 1999 --
Guide des essais de pathogénicité et de toxicité de nouvelles substances microbiennes pour les organismes aquatiques et terrestres SPE 1/RM/44 Mars 2004 --
Document d’orientation sur les méthodes statistiques applicables aux essais d’écotoxicité SPE 1/RM/46 Mars 2005 --

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